从人多能干细胞生成功能性胰腺胰岛素分泌细胞的优化方案

摘要

本文介绍了一种用于β细胞样细胞定向分化和功能分析的方案。我们描述了在产生产生胰岛素的胰腺细胞之前，人类多能干细胞的最佳培养条件和传代。六阶段分化从明确的内胚层形成发展到功能性β细胞样细胞，响应葡萄糖分泌胰岛素。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）可以分化成任何类型的细胞，使其成为人类胰腺β细胞的极好替代来源。hPSC可以是源自囊胚的胚胎干细胞（hESC），也可以是使用重编程过程直接从体细胞产生的诱导多能细胞（hiPSC）。这里提出了一个基于视频的方案，概述了hPSCs在分化和随后产生胰岛素的胰腺细胞之前的最佳培养和传代条件。该方法遵循β细胞定向分化的六阶段过程，其中 hPSC 分化为确定性内胚层 （DE）、原始肠管、后前肠命运、胰腺祖细胞、胰腺内分泌祖细胞，最终分化为胰腺β细胞。值得注意的是，这种分化方法需要 27 天才能产生人胰腺β细胞。通过两个实验评估胰岛素分泌的潜力，包括免疫染色和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

引言

人多能干细胞 （hPSC） 具有分化成各种细胞类型的独特能力，使其成为人胰腺β细胞的可行替代品¹。这些 hPSC 分为两种类型：源自囊胚² 的胚胎干细胞 （hESC） 和通过直接重编程体细胞产生的诱导多能细胞 （hiPSC^{） 3}。开发将 hPSC 分化为 β 细胞的技术对基础研究和临床实践都具有重要意义 ^1,4。糖尿病是一种慢性疾病，影响全球 >4 亿人，是由于胰腺β细胞功能障碍或丢失导致身体无法调节血糖⁵.用于移植的胰岛细胞的有限可用性阻碍了糖尿病细胞替代疗法的发展 2,4,6,7。使用 hPSC 产生葡萄糖反应性胰岛素分泌细胞的能力可作为研究人类胰岛发育和功能的有用细胞模型。它还可用于在受控环境中测试糖尿病治疗的潜在候选治疗药物。此外，hPSC 有可能产生与患者基因相同的胰岛细胞，从而降低移植后免疫排斥的风险 ^2....

研究方案

在开始分化之前，建议确定用于实验目的的胰岛样类器官的所需数量。在 6 孔板中，汇合度超过 80% 的单个孔通常由 2-230 万个 hPSC 组成。虽然由于 hPSC 细胞系和分化效率的变化，准确预测具有挑战性，但粗略估计是初始孔数的 1.5 倍。有效的定向分化通常在六孔板中每孔产生 1.6 至 200 万个细胞，包括簇内的所有细胞，而不是仅产生胰岛素的细胞。对于 50 μm 的团簇，它可以近似包含大约 10,000 个细胞。 表1 总结了在干细胞基质和培养基上用于定向分化的每天/阶段的培养基组成，以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌缓冲液。

1. 在 6 孔板中分化前传代人多能干细胞

注意：在分化为β细胞样细胞之前，人类干细胞的适当传代是建立实验过程的关键步骤。不正确的传代稀释或附着细胞数量会影响分化效率和保真度。

1. 制备干细胞培养基、包衣和解离溶液（如 表1所示）。
2. 传代前1-2小时，用冷包衣溶液（每孔1mL）涂覆六孔板，并在37°C，5%CO₂孵育。
3. 在室温（15-25°C）下加热等分的干细胞培养基20分钟。
4. 吸出干细胞培养基并加入 1 mL 无钙/无镁 D-PBS。
5. 重复步骤 1.4。两次。
   注意：....

讨论

hPSCs成功分化为胰腺β细胞取决于优化所选hPSCs的常规培养和传代的各个方面。这包括确保细胞系具有正常的核型，对支原体感染呈阴性，并且没有质粒或病毒载体基因组。此外，在使用hiPSCs时，重要的是要避免使用仍在进行重编程的最早传代进行试点实验。这些实验应在小规模上进行，以确定具有最佳分化潜力和最佳传代次数的hPSC系。

其他可能影响分化效率的参数包括所用?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750