인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

요약

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

초록

인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있어 인간 췌장 β 세포의 훌륭한 대체 공급원입니다. hPSC는 배반포에서 유래한 배아 줄기 세포(hESC) 또는 재프로그래밍 과정을 사용하여 체세포에서 직접 생성된 유도 만능 세포(hiPSC)일 수 있습니다. 여기에서는 hPSC의 분화 및 인슐린 생산 췌장 세포의 후속 생성 전에 hPSC에 대한 최적의 배양 및 통과 조건을 설명하기 위해 비디오 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 hPSC가 최종 내배엽(DE), 원시 장관, 후장 운명, 췌장 전구 세포, 췌장 내분비 전구 세포, 궁극적으로 췌장 β 세포로 분화하는 β세포 유도 분화를 위한 6단계 과정을 따릅니다. 이 분화 방법론은 인간 췌장 β 세포를 생성하는 데 27일이 걸린다는 점은 주목할 만합니다. 인슐린 분비의 잠재력은 면역염색과 포도당 자극 인슐린 분비를 포함한 두 가지 실험을 통해 평가되었습니다.

서문

인간 만능 줄기세포(hPSC)는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있어 인간 췌장 β세포의 유력한 대안이 될 수 있습니다¹. 이러한 hPSC는 배반포에서 유래한 배아줄기세포(hESC)로 분류된다^.2 체세포^{를 직접 재}프로그래밍하여 생성된 유도만능세포(hiPSC)3. hPSC를 β세포로 분화하는 기술의 개발은 기초 연구와 임상 실습 모두에 중요한 영향을 미칩니다 ^1,4. 진성 당뇨병은 전 세계적으로 4억 > 사람들에게 영향을 미치는 만성 질환으로, 췌장 β세포의 기능 장애 또는 손실로 인해 신체가 혈당을 조절하지 못해 발생합니다⁵. 이식을 위한 췌장 섬 세포의 제한된 가용성은 당뇨병에 대한 세포 대체 요법의 개발을 방해했습니다 2,4,6,7. hPSC를 사용하여 포도당 반....

프로토콜

분화를 시작하기 전에 실험 목적으로 필요한 섬 모양의 오가노이드 수를 결정하는 것이 좋습니다. 6웰 플레이트에서 밀도가 80% 이상인 단일 웰은 일반적으로 2-230만 hPSC로 구성됩니다. hPSC 라인과 분화 효율의 차이로 인해 정확한 예측이 어렵지만, 대략적인 추정치는 초기 웰 수의 1.5배입니다. 효과적으로 유도된 분화는 일반적으로 6웰 플레이트에서 웰당 160만 개에서 200만 개의 세포를 생성하며, 인슐린을 생산하는 세포만 생산하는 것이 아니라 클러스터 내의 모든 세포를 포함합니다. 50μm 클러스터의 경우 약 10,000개의 세포를 포함하는 것으로 추정할 수 있습니다. 표 1 은 포도당 자극 인슐린 분비 완충액과 함께 줄기세포 기질 및 배지 상에 직접 분화의 각 일/단계에 사용되는 배지 조성을 요약한 것입니다.

1. 6 웰 플레이트에서 인간 만능 줄기 세포 사전 분화 통과

참고: β 세포와 유사한 세포로 분화하기 전에 인간 줄기 세포의 적절한 패시징은 실험 과정을 확립하는 데 중요한 단계입니다. 잘못된 통로 희석 또는 부착 세포 수는 분화 효율성과 충실도를 저하시킬 수 있습니다.

1. 줄기 세포 배양 배지, ....

토론

hPSC를 췌장 β세포로 성공적으로 분화하는 것은 선택된 hPSC의 일상적인 배양 및 통과의 모든 측면을 최적화하는 데 달려 있습니다. 여기에는 세포주가 정상적인 핵형을 가지고 있는지, 마이코플라스마 감염에 대해 음성인지, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 게놈이 없는지 확인하는 것이 포함됩니다. 또한, hiPSC를 사용할 때는 파일럿 실험을 위해 아직 재프로그래밍이 진행 중인 가장 빠른 통로를 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750