A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

Abstract

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולים להתמיין לכל סוג של תא, מה שהופך אותם למקור חלופי מצוין לתאי β לבלב אנושיים. hPSCs יכולים להיות תאי גזע עובריים (hESCs) שמקורם בבלסטוציסט או תאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) הנוצרים ישירות מתאים סומטיים באמצעות תהליך תכנות מחדש. כאן מוצג פרוטוקול מבוסס וידאו כדי לתאר את התרבית האופטימלית ואת תנאי המעבר עבור hPSCs, לפני התמיינותם והדור הבא של תאי לבלב מייצרי אינסולין. מתודולוגיה זו עוקבת אחר תהליך בן שישה שלבים להתמיינות מכוונת של β תאים, שבו hPSCs מתמיינים לאנדודרם סופי (DE), צינור מעיים פרימיטיבי, גורל המעי הקדמי האחורי, אבות הלבלב, אבות אנדוקריניים של הלבלב, ובסופו של דבר תאי β של הלבלב. ראוי לציין כי מתודולוגיית התמיינות זו לוקחת תקופה של 27 ימים כדי ליצור תאי β הלבלב האנושי. הפוטנציאל של הפרשת אינסולין הוערך באמצעות שני ניסויים, שכללו הפרשת אינסולין ממריצה חיסונית והפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

Introduction

לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יש יכולת ייחודית להתמיין לסוגי תאים שונים, מה שהופך אותם לחלופה בת קיימא לתאי β של הלבלב האנושי1. תאי גזע עובריים (hESCs) אלה מסווגים לשני סוגים: תאי גזע עובריים (hESCs), הנגזרים מהבלסטוציסט2, ותאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs), הנוצרים על ידי תכנות מחדש של תאים סומטיים ישירות3. לפיתוח טכניקות להתמיין hPSCs לתאי β, יש השלכות חשובות הן על המחקר הבסיסי והן על הפרקטיקה הקלינית 1,4. סוכרת היא מחלה כרונית המשפיעה על >400 מיליון אנשים ברחבי העולם ונובעת מחוסר היכולת של הגוף לווסת את הגליקמיה עקב תקלה או או....

Protocol

לפני תחילת ההבחנה, מומלץ לקבוע את המספר הנדרש של אורגנואידים דמויי איון למטרות ניסוי. בצלחת של 6 בארות, באר אחת עם מפגש של מעל 80% מורכבת בדרך כלל מ-2-2.3 מיליון hPSCs. בעוד שתחזית מדויקת מאתגרת בשל שינויים בקווי hPSC ויעילות הבידול, הערכה גסה היא פי 1.5 ממספר הבארות הראשוניות. התמיינות מכוונת יעילה מניבה בדרך כלל 1.6 עד 2 מיליון תאים לבאר בשש צלחות באר, המקיפות את כל התאים בתוך הצבירים ולא רק תאים מייצרי אינסולין. עבור צביר של 50 מיקרומטר, ניתן להעריך שהוא מכיל כ-10,000 תאים. טבלה 1 מספקת סיכום של הרכב המדיה המשמש לכל יום/שלב של התמיינות מכוונת על גבי מטריצת תאי גזע ומדיום, יחד עם מאגר הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

1.....

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציע גישה יעילה ביותר להבחנה בין תאים דמויי β לבין hPSCs10. תהליך זה משתמש במערכת תרבות דו-ממדית הניתנת להרחבה בקלות, ומאפשרת את השימוש בה בסביבות ניסוי שונות, כגון בידול למידה, פרויקטים קטנים יותר ומעבדות, ובדיקות פיילוט להערכת הפוטנציאל של קו iPSC לבידול.......

Discussion

ההתמיינות המוצלחת של hPSCs לתאי β בלבלב תלויה במיטוב כל ההיבטים של תרבית שגרתית ומעבר של hPSCs שנבחרו. זה כולל להבטיח כי קו התא יש קריוטיפ נורמלי, הוא שלילי עבור זיהום מיקופלסמה, והוא ללא פלזמה או גנום וקטורי ויראלי. יתר על כן, בעת שימוש ב- hiPSCs, חשוב להימנע משימוש במעבר המוקדם ביותר שעדיין עובר תכ?.......

Acknowledgements

אינס צ'רקאווי נתמכה על ידי מלגת סוכרת בריטניה (BDA 18/0005934) ל- GAR, שגם מודה לקרן Wellcome עבור פרס חוקר (212625/Z/18/Z), UKRI MRC עבור מענק תוכנית (MR/R022259/1), סוכרת בריטניה עבור מענק פרויקט (BDA16/0005485), CRCHUM עבור קרנות הזנק, חדשנות קנדה עבור פרס מנהיג ג'ון ר. אוונס (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) עבור מענק פרויקט, ו-CIHR, JDRF עבור מענק צוות (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). קמיל דיון וד"ר הארי ליטץ' על עזרתם ביצירת תאי גזע גזעיים אנושיים ובתרבותם, מתקן האורגנואידים NIHR Imperial BRC (מרכז המחקר הביו-רפואי), לונדון.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

References

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. <....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved