פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

Abstract

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולים להתמיין לכל סוג של תא, מה שהופך אותם למקור חלופי מצוין לתאי β לבלב אנושיים. hPSCs יכולים להיות תאי גזע עובריים (hESCs) שמקורם בבלסטוציסט או תאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) הנוצרים ישירות מתאים סומטיים באמצעות תהליך תכנות מחדש. כאן מוצג פרוטוקול מבוסס וידאו כדי לתאר את התרבית האופטימלית ואת תנאי המעבר עבור hPSCs, לפני התמיינותם והדור הבא של תאי לבלב מייצרי אינסולין. מתודולוגיה זו עוקבת אחר תהליך בן שישה שלבים להתמיינות מכוונת של β תאים, שבו hPSCs מתמיינים לאנדודרם סופי (DE), צינור מעיים פרימיטיבי, גורל המעי הקדמי האחורי, אבות הלבלב, אבות אנדוקריניים של הלבלב, ובסופו של דבר תאי β של הלבלב. ראוי לציין כי מתודולוגיית התמיינות זו לוקחת תקופה של 27 ימים כדי ליצור תאי β הלבלב האנושי. הפוטנציאל של הפרשת אינסולין הוערך באמצעות שני ניסויים, שכללו הפרשת אינסולין ממריצה חיסונית והפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

Introduction

לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יש יכולת ייחודית להתמיין לסוגי תאים שונים, מה שהופך אותם לחלופה בת קיימא לתאי β של הלבלב האנושי¹. תאי גזע עובריים (hESCs) אלה מסווגים לשני סוגים: תאי גזע עובריים (hESCs), הנגזרים מהבלסטוציסט², ותאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs), הנוצרים על ידי תכנות מחדש של תאים סומטיים ישירות³. לפיתוח טכניקות להתמיין hPSCs לתאי β, יש השלכות חשובות הן על המחקר הבסיסי והן על הפרקטיקה הקלינית ^1,4. סוכרת היא מחלה כרונית המשפיעה על >400 מיליון אנשים ברחבי העולם ונובעת מחוסר היכולת של הגוף לווסת את הגליקמיה עקב תקלה או או....

Protocol

לפני תחילת ההבחנה, מומלץ לקבוע את המספר הנדרש של אורגנואידים דמויי איון למטרות ניסוי. בצלחת של 6 בארות, באר אחת עם מפגש של מעל 80% מורכבת בדרך כלל מ-2-2.3 מיליון hPSCs. בעוד שתחזית מדויקת מאתגרת בשל שינויים בקווי hPSC ויעילות הבידול, הערכה גסה היא פי 1.5 ממספר הבארות הראשוניות. התמיינות מכוונת יעילה מניבה בדרך כלל 1.6 עד 2 מיליון תאים לבאר בשש צלחות באר, המקיפות את כל התאים בתוך הצבירים ולא רק תאים מייצרי אינסולין. עבור צביר של 50 מיקרומטר, ניתן להעריך שהוא מכיל כ-10,000 תאים. טבלה 1 מספקת סיכום של הרכב המדיה המשמש לכל יום/שלב של התמיינות מכוונת על גבי מטריצת תאי גזע ומדיום, יחד עם מאגר הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.

1.....

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציע גישה יעילה ביותר להבחנה בין תאים דמויי β לבין hPSCs¹⁰. תהליך זה משתמש במערכת תרבות דו-ממדית הניתנת להרחבה בקלות, ומאפשרת את השימוש בה בסביבות ניסוי שונות, כגון בידול למידה, פרויקטים קטנים יותר ומעבדות, ובדיקות פיילוט להערכת הפוטנציאל של קו iPSC לבידול.......

Discussion

ההתמיינות המוצלחת של hPSCs לתאי β בלבלב תלויה במיטוב כל ההיבטים של תרבית שגרתית ומעבר של hPSCs שנבחרו. זה כולל להבטיח כי קו התא יש קריוטיפ נורמלי, הוא שלילי עבור זיהום מיקופלסמה, והוא ללא פלזמה או גנום וקטורי ויראלי. יתר על כן, בעת שימוש ב- hiPSCs, חשוב להימנע משימוש במעבר המוקדם ביותר שעדיין עובר תכ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750