A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.
תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולים להתמיין לכל סוג של תא, מה שהופך אותם למקור חלופי מצוין לתאי β לבלב אנושיים. hPSCs יכולים להיות תאי גזע עובריים (hESCs) שמקורם בבלסטוציסט או תאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) הנוצרים ישירות מתאים סומטיים באמצעות תהליך תכנות מחדש. כאן מוצג פרוטוקול מבוסס וידאו כדי לתאר את התרבית האופטימלית ואת תנאי המעבר עבור hPSCs, לפני התמיינותם והדור הבא של תאי לבלב מייצרי אינסולין. מתודולוגיה זו עוקבת אחר תהליך בן שישה שלבים להתמיינות מכוונת של β תאים, שבו hPSCs מתמיינים לאנדודרם סופי (DE), צינור מעיים פרימיטיבי, גורל המעי הקדמי האחורי, אבות הלבלב, אבות אנדוקריניים של הלבלב, ובסופו של דבר תאי β של הלבלב. ראוי לציין כי מתודולוגיית התמיינות זו לוקחת תקופה של 27 ימים כדי ליצור תאי β הלבלב האנושי. הפוטנציאל של הפרשת אינסולין הוערך באמצעות שני ניסויים, שכללו הפרשת אינסולין ממריצה חיסונית והפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.
לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יש יכולת ייחודית להתמיין לסוגי תאים שונים, מה שהופך אותם לחלופה בת קיימא לתאי β של הלבלב האנושי1. תאי גזע עובריים (hESCs) אלה מסווגים לשני סוגים: תאי גזע עובריים (hESCs), הנגזרים מהבלסטוציסט2, ותאים פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs), הנוצרים על ידי תכנות מחדש של תאים סומטיים ישירות3. לפיתוח טכניקות להתמיין hPSCs לתאי β, יש השלכות חשובות הן על המחקר הבסיסי והן על הפרקטיקה הקלינית 1,4. סוכרת היא מחלה כרונית המשפיעה על >400 מיליון אנשים ברחבי העולם ונובעת מחוסר היכולת של הגוף לווסת את הגליקמיה עקב תקלה או או....
לפני תחילת ההבחנה, מומלץ לקבוע את המספר הנדרש של אורגנואידים דמויי איון למטרות ניסוי. בצלחת של 6 בארות, באר אחת עם מפגש של מעל 80% מורכבת בדרך כלל מ-2-2.3 מיליון hPSCs. בעוד שתחזית מדויקת מאתגרת בשל שינויים בקווי hPSC ויעילות הבידול, הערכה גסה היא פי 1.5 ממספר הבארות הראשוניות. התמיינות מכוונת יעילה מניבה בדרך כלל 1.6 עד 2 מיליון תאים לבאר בשש צלחות באר, המקיפות את כל התאים בתוך הצבירים ולא רק תאים מייצרי אינסולין. עבור צביר של 50 מיקרומטר, ניתן להעריך שהוא מכיל כ-10,000 תאים. טבלה 1 מספקת סיכום של הרכב המדיה המשמש לכל יום/שלב של התמיינות מכוונת על גבי מטריצת תאי גזע ומדיום, יחד עם מאגר הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז.
1.....
הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציע גישה יעילה ביותר להבחנה בין תאים דמויי β לבין hPSCs10. תהליך זה משתמש במערכת תרבות דו-ממדית הניתנת להרחבה בקלות, ומאפשרת את השימוש בה בסביבות ניסוי שונות, כגון בידול למידה, פרויקטים קטנים יותר ומעבדות, ובדיקות פיילוט להערכת הפוטנציאל של קו iPSC לבידול.......
ההתמיינות המוצלחת של hPSCs לתאי β בלבלב תלויה במיטוב כל ההיבטים של תרבית שגרתית ומעבר של hPSCs שנבחרו. זה כולל להבטיח כי קו התא יש קריוטיפ נורמלי, הוא שלילי עבור זיהום מיקופלסמה, והוא ללא פלזמה או גנום וקטורי ויראלי. יתר על כן, בעת שימוש ב- hiPSCs, חשוב להימנע משימוש במעבר המוקדם ביותר שעדיין עובר תכ?.......
אינס צ'רקאווי נתמכה על ידי מלגת סוכרת בריטניה (BDA 18/0005934) ל- GAR, שגם מודה לקרן Wellcome עבור פרס חוקר (212625/Z/18/Z), UKRI MRC עבור מענק תוכנית (MR/R022259/1), סוכרת בריטניה עבור מענק פרויקט (BDA16/0005485), CRCHUM עבור קרנות הזנק, חדשנות קנדה עבור פרס מנהיג ג'ון ר. אוונס (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) עבור מענק פרויקט, ו-CIHR, JDRF עבור מענק צוות (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). קמיל דיון וד"ר הארי ליטץ' על עזרתם ביצירת תאי גזע גזעיים אנושיים ובתרבותם, מתקן האורגנואידים NIHR Imperial BRC (מרכז המחקר הביו-רפואי), לונדון.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Ethanol | VWR | 20821.33 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved