JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول لتقييم القتل الكمي للخلايا السرطانية بواسطة خلايا جوركات التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) التي تستهدف مستضد الورم المفرد. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمنصة فحص للتحسين السريع لتركيبات مفصلات CAR قبل التأكيد في الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي.

Abstract

الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) هي في طليعة علم الأورام. يتم إنشاء CAR من مجال استهداف (عادة ما يكون جزءا متغيرا أحادي السلسلة ، scFv) ، مع رابط مصاحب داخل السلسلة ، متبوعا بمفصلة ، وغشاء ، ومجال تكلفة. يمكن أن يكون لتعديل مجال الربط داخل السلسلة والمفصلة تأثير كبير على القتل بوساطة CAR. بالنظر إلى العديد من الخيارات المختلفة لكل جزء من بناء CAR ، هناك أعداد كبيرة من التباديل. يعد صنع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة ، كما أن صنع واختبار العديد من التركيبات يعد استثمارا ثقيلا وماديا. يصف هذا البروتوكول منصة للتقييم السريع لبنيات CAR المحسنة للمفصلات في خلايا Jurkat (CAR-J). خلايا Jurkat عبارة عن خط خلايا تائية خلد مع امتصاص عالي لفيروس العدس ، مما يسمح بنقل CAR بكفاءة. هنا ، نقدم منصة لتقييم CAR-J بسرعة باستخدام جهاز تصوير الفلورسنت ، متبوعا بتأكيد التحلل الخلوي في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.

Introduction

أظهر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وعدا كبيرا في الأورام الخبيثة الدموية ، وهو ما يتضح من 6 منتجات CAR-T المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء منذ عام 2017 ، كما أفاد المعهد الوطني للسرطان1. هناك العديد من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في التجارب السريرية لاستهداف الأورام الصلبة. تعد أهداف CAR الجديدة الهندسية وتحسين بنية CAR أمرا حيويا لفعالية خلية CAR-T. يعد اختيار بنية CAR المثالية لكل تطبيق أمرا ضروريا للاستهداف الدقيق للمستضدات المرتبطة بالورم (TAA) مع تجنب المستويات المنخفضة من تعبير TAA في الأنسجة الطبيعية2.

يتكون بناء CAR بشكل أساسي من خمس مقصورات: (1) مجال الجزء المتغير أحادي السلسلة خارج الخلية (scFv) الذي يستهدف مستضد الورم. (2) مجال المفصلات. (3) المجال عبر الغشاء. (4) المجال المكلف للخلايا التائية السيتوبلازمية داخل الخلايا ؛ و (5) مجال الإشارة. يؤثر تعديل كل مجال من هذه المجالات على دقة الخلية التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تتعامل مع الخلية المستهدفة3. ومن ثم ، فإن تقييم السمية الخلوية والتفاعل المتبادل لهذه التركيبات CAR في المختبر أمر بالغ الأهمية لاختيار البنية الصحيحة للتقدم نحو التجارب في الجسم الحي. تشمل الطرق الحالية لتقييم التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية مقايسة إطلاق 51Cr ، ومقايسة إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات ، ومقايسة التصوير الحيوي ، وتحليل الخلايا القائم على المعاوقة في الوقت الفعلي ، ومقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا 4,5. تحدد المنصة القائمة على التصوير الفلوري الموصوفة هنا عدد الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة ، وهو تقدير كمي مباشر للتحلل الخلوي للخلايا التائية بدلا من طريقة غير مباشرة لتقييم التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية.

إليك تقنية سهلة وفعالة من حيث التكلفة وسريعة وعالية الإنتاجية مع الحد الأدنى من التدخل لتقييم السمية الخلوية لخلايا Jurkat التي تعبر عن مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) CAR ضد خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي MDA-MB-231 (TNBC) و EGFR CRISPR تضرب خلايا MDA-MB-231. خلايا Jurkat هي خلايا الخلايا اللمفاوية التائية البشرية6 التي تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة تنشيط الخلايا التائية وآليات الإشارة7. علاوة على ذلك ، تم استخدام خلايا Jurkat لاختبار CAR في المختبر في دراسات متعددة8،9،10،11. يتم تحويل خلايا Jurkat بسهولة بواسطة فيروس lentivirus ولها تكاثر مستدام ، وقد تم الاستفادة من هذا النظام لتحسين المجال المفصلي لمختلف تركيبات EGFR CAR.

يمكن استخدام هذا الاختبار لفحص تركيبات CAR المتعددة التي تستهدف مستضدات الورم المختلفة واستخدامها ضد خطوط الخلايا السرطانية المتعددة الملتصقة وبنسب مختلفة من المستجيب إلى الورم (E: T). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم نقاط زمنية متعددة ، ويمكن تعديل عدد النسخ المتماثلة لتحديد أفضل قتل بين مختلف هياكل CAR. يجب تأكيد أفضل التركيبات باستخدام خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMCs) المشتقة من خلايا CD3 T. الهدف العام وراء تطوير هذه الطريقة هو التحسين السريع لهندسة مفصلات CAR بطريقة عالية الإنتاجية للتغلب على الحواجز مثل كفاءة النقل المنخفضة ، متبوعة بتأكيد في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.

Protocol

ملاحظة: تتم جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية مع معطف المختبر والقفازات واتباع تقنيات التعقيم القياسية.

1. توليد CAR التعبير عن Jurkats (CAR-J)

  1. شراء خلايا Jurkat ، استنساخ E6-1 من ATCC. قم بإذابة 1 × 106 خلايا في قارورة T-75 واستزراعها في قوارير T-75. احتفظ بها معلقة عند 0.6 × 106 خلايا لكل مل باستخدام وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المكملة ب 10٪ FBS في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. صفيحة 1 × 105 خلايا جوركات لكل بئر من زراعة الأنسجة عالجت 24 صفيحة بئر في 500 ميكرولتر من وسائط نمو RPMI تحتوي على 4 ميكروغرام / مل بوليبرين مما يعزز كفاءة الفيروسات العدسية. عد الخلايا باستخدام محلل الخلايا العلوية لمنضدة الكشف عن الفلورسنت القائم على الليزر. يعتمد عدد الآبار على عدد الإنشاءات المراد تقييمها. سيستخدم هذا المثال 4 بنيات وعنصر تحكم غير محول. يظهر تصميم بناء CAR في الجدول 1.
  3. أضف 10 ميكرولتر من فيروس عدسي / بئر من كل بناء CAR. تم تصميم بناء CAR وإنتاج فيروس lentivirus كما هو موضح سابقا12.
  4. في اليوم التالي ، أضف 1 مل من وسائط RPMI للنمو إلى كل بئر واستمر في الزراعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  5. جمع الخلايا 2 أيام في وقت لاحق (مجموع 72 ساعة بعد نقل Jurkat) وعدها.
  6. خذ 1 × 104 خلايا لتشغيل التدفق لتأكيد تعبير CAR على خلايا Jurkat. باختصار ، اغسل الخلايا 2x بمحلول تلطيخ FACS (FSS) قبل وضع علامة CAR-J بالأجسام المضادة التي تستهدف علامة العلم المستخدمة للكشف عن إيجابية CAR لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x مرة أخرى باستخدام FSS وقم بتشغيل الخلايا من خلال مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا12. استخدم تركيز الأجسام المضادة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
  7. يتم تحويل خلايا Jurkat بسهولة وتظهر دائما تعبير CAR بنسبة >90٪. قم بإنتاج CAR-J قبل فترة طويلة من مقايسة السمية الخلوية للثقافة المشتركة وقم بتجميدها لاستخدامها لاحقا.

2. تصفيح الخلايا السرطانية المسمى CFSE

ملاحظة: كانت خلايا MDA-MB-231 (من ATCC ، HTB-26) هدية من متعاون ، وتم إنشاء EGFR KO MDA-MB-231 كما هو موضح سابقا12.

  1. قم بإذابة 1 × 106 خلايا في قارورة T-75 واستزراعها في قوارير T-75. الحفاظ على الخلايا السرطانية MDA-MB-231 والخلايا السرطانية CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 في 14 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والانقسام عند التقاء 70٪ تقريبا.
  2. راقب الخلايا السرطانية الملتصقة تحت مجهر برايت فيلد العادي لضمان التقاء ما يقرب من 70٪.
  3. قم بإزالة وسائط النمو من القارورة باستخدام ماصة مصلية. أضف 3 مل من التربسين إلى دورق T75 وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3-5 دقائق لفصل الخلايا عن القارورة.
  4. تحييد التربسين باستخدام كمية متساوية (3 مل) من وسائط النمو. اجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي وقم بتدوير الخلايا بسرعة 400 × جم لمدة 4 دقائق لتكسير الخلايا.
  5. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). أوجد تركيز الخلية باستخدام عداد خلوي.
  6. انقل 8 × 105 خلايا إلى أنبوب آخر سعة 15 مل وأضف PBS ليصل حجمه إلى 1 مل.
  7. أضف 2 ميكرولتر من إستر كربوكسي فلوريسئين سكسينيميديل (CFSE ؛ تركيز مخزون 5 ميكرومتر) في كل أنبوب واخلطه جيدا باستخدام ماصة 1 مل.
  8. احتضان الخلايا مع CFSE لمدة 20 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. أخرج الأنابيب من الحاضنة بعد 20 دقيقة وأضف 5 مل من وسائط النمو إلى الأنبوب.
  9. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 400 × غرام لمدة 4 دقائق لبيليه أسفل الخلايا المسمى CFSE. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 1 مل من الوسائط الطازجة لإعادة تعليق الخلايا.
  10. أعد تقييم تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية. نقل 4 × 105 خلايا إلى خزان كاشف 25 مل وإضافة وسائط لحجم إجمالي قدره 8 مل.
    1. لضمان حجم كاف لزرع 5000 خلية سرطانية / بئر في 100 ميكرولتر من الوسائط ، يجب أن يكون الحجم قادرا على الماصة باستخدام الماصة متعددة القنوات ، وللتعويض عن فقدان عدد قليل من الخلايا خلال الخطوة 1.7 ، قم بإعداد 10٪ -20٪ خلايا إضافية وحجم الوسائط.
  11. امزج تعليق الخلية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل جيدا. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 100 ميكرولتر ، ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل صف من لوحة البئر السوداء 96 ذات القاع المسطح الشفافة في النصف الأيسر. يمكن العثور على استراتيجية طلاء عينة في الجدول 2.
  12. خلايا ماصة EGFR KO بالمثل على النصف الأيمن من اللوحة. بمجرد طلاء اللوحة بأكملها ، اسحب اللوحة ذهابا وإيابا وجنبا إلى جنب على منصة غطاء زراعة الأنسجة لضمان التوزيع الموحد للخلايا السرطانية في الآبار.
  13. احتضان اللوحة لمدة 4 ساعات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للخلايا السرطانية لتعلق.

3. المشاركة في زراعة CAR للتعبير عن Jurkats مع الخلايا السرطانية المسماة CFSE

  1. باستخدام عدد الخلايا غير المحولة وخلايا CAR التي تعبر عن Jurkat ، انقل 4 × 105 خلايا من كل CAR-J إلى خزان سعة 25 مل. أضف وسائط نمو DMEM لحجم إجمالي قدره 2 مل.
  2. بالنسبة ل E: T من 4: 1 ، تمت إضافة 2 × 104 CAR-J لكل بئر في 100 ميكرولتر من الوسائط باستخدام ماصة متعددة القنوات برفق على طول جانب كل بئر حتى لا تزعج الخلايا السرطانية المرفقة.
  3. أضف 100 ميكرولتر أخرى من وسائط النمو باستخدام ماصة متعددة القنوات إلى جانب الآبار التي تحتوي على الخلايا السرطانية وخلايا Jurkat. تحصل مجموعات الورم فقط على 200 ميكرولتر من الوسائط ليصبح المجموع 300 ميكرولتر من الوسائط في جميع الآبار.
  4. اسحب اللوحة على طول المنصة ذهابا وإيابا وحركة من جانب إلى آخر لضمان توزيع موحد لخلايا Jurkat على الخلايا السرطانية.
  5. السماح بالاستزراع المشترك في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.

4. إعداد لوحة للتصوير

  1. اصنع محلولا من يوديد البروبيديوم (PI) عند 1 ميكروغرام / مل في وسائط مضان منخفضة الخلفية بناء على عدد الآبار ويحصل كل منها على 100 ميكرولتر من الوسائط.
  2. ل 84 بئرا إعداد 9 مل من الوسائط التي تحتوي على PI. امزج الوسائط جيدا باستخدام ماصة.
  3. اصنع 10 مل من محلول Triton-X بنسبة 20٪ عن طريق تخفيف Triton-X بالماء منزوع الأيونات. بعد 48 ساعة من الاستزراع المشترك ، تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على CAR-J عن طريق انعكاس واحد للوحة والنقر على منشفة ورقية.
  4. أضف الآن 100 ميكرولتر من الوسائط المعدة أعلاه (الخطوة 4.2) التي تحتوي على PI في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات برفق حتى لا تزعج الخلايا السرطانية الملتصقة.
  5. أضف 20 ميكرولتر من محلول Triton-X بنسبة 20٪ إلى البئر الأول من كل نوع من أنواع الأورام التي تعمل كتحكم كامل في الموتى.
  6. اترك اللوحة في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. تخيل اللوحة باستخدام مقياس التصوير الخلوي بالفلورسنت. يتم تخزين البيانات على الكمبيوتر ويمكن تحليلها في وقت لاحق.

5. تحليل صور الفلورسنت

  1. استخدم أحد الخلايا الموجودة في الورم فقط لضبط قناة الفلورسنت الخضراء.
  2. قم بتقليل قناع البئر إلى 98٪ لإزالة الخلايا الموجودة على حافة البئر لأن الإشارة ليست مثالية على الحافة.
  3. تحديد الخلايا السرطانية الموسومة ب CFSE على قناة CFSE الخضراء الفلورية. قم بتعديل قيمة عتبة شدة التألق لالتقاط جميع الخلايا الموجودة على البئر.
  4. اضبط الحد الأدنى لقطر الخلية على 25 ميكرومتر لإزالة أي حطام تم اكتشافه على قناة CFSE. يختلف هذا حسب نوع الخلية التي يتم تحليلها.
  5. قم بتمكين كائنات لمس منفصلة لتعريف الخلايا المنفردة عندما تكون على اتصال مع بعضها البعض.
  6. حدد CFSE على شاشة الصورة وانظر إلى تراكب الرسوم لمعرفة ما يتم اختياره بواسطة النظام.
  7. بمجرد التقاط الخلايا التي تحمل علامة CFSE بشكل صحيح ، قم بتعيين بوابات لتحديد عدد الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة.
  8. عند اختيار الخلايا المسماة CFSE ، قم بإنشاء رسم بياني للأعداد على المحور y مقابل متوسط كثافة PI على المحور x.
  9. استنادا إلى البئر حيث أضفنا Triton-X (الخطوة 4.5) ، ارسم مقسم للتمييز بين الخلايا منخفضة PI الملطخة مقابل الخلايا عالية PI. يجب أن يحتوي هذا البئر على معظم الخلايا في منطقة عالية ملطخة ب PI.
    ملاحظة: يظهر PI الإشارة القاعدية على الخلايا الحية. ومن ثم ، فإن إضافة Triton-X يقتل جميع الخلايا والبقع الساطعة في قناة الفلورسنت الحمراء. هذا يسهل رسم البوابات لفصل الخلايا الميتة عن الخلايا الحية.
  10. اضبط قيمة المحور السيني لتكون أكثر قدرة على عرض الخلايا. الآن قم بتسمية الخلايا منخفضة التلطيخ ب PI على أنها خلايا حية.
  11. عند تحديد الخلايا الحية ، قم بتعيين مدرج تكراري آخر بمساحة على المحور السيني وحسابه على المحور ص.
  12. ارسم مقسم آخر باستخدام الورم جيدا فقط لالتقاط الخلايا وليس الحطام. ستبدأ الآبار المعالجة بجوركات في تراكم الحطام الذي سيكون ملطخا ب CFSE ويحتاج إلى إزالته من العد. يتم تصنيف ما تبقى من غير الحطام على أنه "خلايا كبيرة".
  13. قم بتشغيل التحليل على اللوحة بأكملها وقم بتصدير جدول البيانات الذي يحتوي على الأرقام.
  14. ارسم الأعداد الكبيرة لتحديد عدد الخلايا السرطانية الحية التي تحمل علامة CFSE المتبقية في البئر بعد التعرض ل CAR-J. تحديد الإحصائيات باستخدام ANOVA.

النتائج

تم تقييم نطاق نسبة E: T بين 1: 8 و 8: 1 ل CAR-J1 عند 72 ساعة والتي استهدفت EGFR على خلايا TNBC MDA-MB-231. تم تحويل خلايا Jurkat مع فيروس CAR lentivirus مع البوليبرين لتوليد خلايا CAR-J كما هو موضح في الخطوة 2. زادت السمية الخلوية ل CAR-J1 بشكل ملحوظ مع ارتفاع نسبة E: T مع عدم وجود فرق في القتل بنسبة 1: 8 (الشكل 1). لو...

Discussion

لقد اقترحنا هنا طريقة سريعة لتقييم النشاط الخلوي الخاص بالهدف الناجم عن تعبير CAR في خلايا Jurkat بكفاءة. جميع تركيبات CAR لها نفس scFv ولكن مجالات مفصلية وغشائية مختلفة ثبت أنها تؤثر على فاعلية الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضداتالوهمية 13. تم إجراء مزيد من التقييم للقتل غير النو?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

كانت MDA-MB-231 هدية كريمة من الدكتور شين ستيكلين. يقر المؤلفون بالتمويل من مركز السرطان بجامعة كانساس لإجراء هذا البحث.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Tube (Sterile)Midwest Scientific#C15BAny similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)Thermo Scientific339652Any similar will work
Black/Clear 96 well plateFalcon353219Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CAny similar will work
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersion 5.3.0.0Any similar will work
Cell Culture IncubatorThermo ScientificHeraCell 160iAny similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)TPP90076Any similar will work
CFSETonbo13-0850-U500Any similar will work
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Any similar will work
DMEMGibco11995-040Any similar will work
FBSGemini bio-products900-108Any similar will work
Flow CytometerCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcAny similar will work
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Company Version 10.7.1Any similar will work
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Any similar will work
GraphPad SoftwareGraphPadVersion 9.3.1 (471)Any similar will work
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
PBSGibco10010-031Any similar will work
PenStrepGibco15070-063Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)Pr1maPR-1250RK-FL, etcAny similar will work
Pipettors Thermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
Propidium IodideInvitrogenP1304MPAny similar will work
RPMICorning10-041-cvAny similar will work
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)Pr1maPR-SERO-25, etcAny similar will work
Sodium PyruvateCorning25-000-CIAny similar will work
Sterile ReservoirsMidwest ScientificRESE-2000Any similar will work
Table top centrifugeEppendorf5810RAny similar will work

References

  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
  4. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
  5. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  6. Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
  7. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
  8. Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
  9. Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
  10. Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
  11. Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
  12. Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
  13. Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
  14. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  15. Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
  16. Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
  17. Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
  18. Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
  19. Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
  20. . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
  21. Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CAR T CAR CAR CAR T CAR Jurkat Lentivirus CAR PBMC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved