تقييم سريع للسمية الخلوية في المختبر لمستقبلات المستضد الخيمري المعبرة عن Jurkat باستخدام التصوير الفلوري

Summary

بروتوكول لتقييم القتل الكمي للخلايا السرطانية بواسطة خلايا جوركات التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) التي تستهدف مستضد الورم المفرد. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمنصة فحص للتحسين السريع لتركيبات مفصلات CAR قبل التأكيد في الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي.

Abstract

الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) هي في طليعة علم الأورام. يتم إنشاء CAR من مجال استهداف (عادة ما يكون جزءا متغيرا أحادي السلسلة ، scFv) ، مع رابط مصاحب داخل السلسلة ، متبوعا بمفصلة ، وغشاء ، ومجال تكلفة. يمكن أن يكون لتعديل مجال الربط داخل السلسلة والمفصلة تأثير كبير على القتل بوساطة CAR. بالنظر إلى العديد من الخيارات المختلفة لكل جزء من بناء CAR ، هناك أعداد كبيرة من التباديل. يعد صنع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة ، كما أن صنع واختبار العديد من التركيبات يعد استثمارا ثقيلا وماديا. يصف هذا البروتوكول منصة للتقييم السريع لبنيات CAR المحسنة للمفصلات في خلايا Jurkat (CAR-J). خلايا Jurkat عبارة عن خط خلايا تائية خلد مع امتصاص عالي لفيروس العدس ، مما يسمح بنقل CAR بكفاءة. هنا ، نقدم منصة لتقييم CAR-J بسرعة باستخدام جهاز تصوير الفلورسنت ، متبوعا بتأكيد التحلل الخلوي في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.

Introduction

أظهر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وعدا كبيرا في الأورام الخبيثة الدموية ، وهو ما يتضح من 6 منتجات CAR-T المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء منذ عام 2017 ، كما أفاد المعهد الوطني للسرطان¹. هناك العديد من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في التجارب السريرية لاستهداف الأورام الصلبة. تعد أهداف CAR الجديدة الهندسية وتحسين بنية CAR أمرا حيويا لفعالية خلية CAR-T. يعد اختيار بنية CAR المثالية لكل تطبيق أمرا ضروريا للاستهداف الدقيق للمستضدات المرتبطة بالورم (TAA) مع تجنب المستويات المنخفضة من تعبير TAA في الأنسجة الطبيعية².

يتكون بناء CAR بشكل أساسي من خمس مقصورات: ....

Protocol

ملاحظة: تتم جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية مع معطف المختبر والقفازات واتباع تقنيات التعقيم القياسية.

1. توليد CAR التعبير عن Jurkats (CAR-J)

1. شراء خلايا Jurkat ، استنساخ E6-1 من ATCC. قم بإذابة 1 × 10⁶ خلايا في قارورة T-75 واستزراعها في قوارير T-75. احتفظ بها معلقة عند 0.6 × 10⁶ خلايا لكل مل باستخدام وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المكملة ب 10٪ FBS في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
2. صفيحة 1 × 10⁵ خلايا جوركات لكل بئر من زراعة الأنسجة عالجت 24 صفيحة بئر في 500 ميكرولتر من وسائط نمو RPMI تحتوي على 4 ميكروغرام / مل بوليبرين مما يعزز كف....

النتائج

تم تقييم نطاق نسبة E: T بين 1: 8 و 8: 1 ل CAR-J1 عند 72 ساعة والتي استهدفت EGFR على خلايا TNBC MDA-MB-231. تم تحويل خلايا Jurkat مع فيروس CAR lentivirus مع البوليبرين لتوليد خلايا CAR-J كما هو موضح في الخطوة 2. زادت السمية الخلوية ل CAR-J1 بشكل ملحوظ مع ارتفاع نسبة E: T مع عدم وجود فرق في القتل بنسبة 1: 8 (الشكل 1). لو.......

Discussion

لقد اقترحنا هنا طريقة سريعة لتقييم النشاط الخلوي الخاص بالهدف الناجم عن تعبير CAR في خلايا Jurkat بكفاءة. جميع تركيبات CAR لها نفس scFv ولكن مجالات مفصلية وغشائية مختلفة ثبت أنها تؤثر على فاعلية الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات^{الوهمية 13}. تم إجراء مزيد من التقييم للقتل غير النو?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work