A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول لتقييم القتل الكمي للخلايا السرطانية بواسطة خلايا جوركات التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) التي تستهدف مستضد الورم المفرد. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمنصة فحص للتحسين السريع لتركيبات مفصلات CAR قبل التأكيد في الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي.

Abstract

الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) هي في طليعة علم الأورام. يتم إنشاء CAR من مجال استهداف (عادة ما يكون جزءا متغيرا أحادي السلسلة ، scFv) ، مع رابط مصاحب داخل السلسلة ، متبوعا بمفصلة ، وغشاء ، ومجال تكلفة. يمكن أن يكون لتعديل مجال الربط داخل السلسلة والمفصلة تأثير كبير على القتل بوساطة CAR. بالنظر إلى العديد من الخيارات المختلفة لكل جزء من بناء CAR ، هناك أعداد كبيرة من التباديل. يعد صنع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة ، كما أن صنع واختبار العديد من التركيبات يعد استثمارا ثقيلا وماديا. يصف هذا البروتوكول منصة للتقييم السريع لبنيات CAR المحسنة للمفصلات في خلايا Jurkat (CAR-J). خلايا Jurkat عبارة عن خط خلايا تائية خلد مع امتصاص عالي لفيروس العدس ، مما يسمح بنقل CAR بكفاءة. هنا ، نقدم منصة لتقييم CAR-J بسرعة باستخدام جهاز تصوير الفلورسنت ، متبوعا بتأكيد التحلل الخلوي في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.

Introduction

أظهر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وعدا كبيرا في الأورام الخبيثة الدموية ، وهو ما يتضح من 6 منتجات CAR-T المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء منذ عام 2017 ، كما أفاد المعهد الوطني للسرطان1. هناك العديد من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في التجارب السريرية لاستهداف الأورام الصلبة. تعد أهداف CAR الجديدة الهندسية وتحسين بنية CAR أمرا حيويا لفعالية خلية CAR-T. يعد اختيار بنية CAR المثالية لكل تطبيق أمرا ضروريا للاستهداف الدقيق للمستضدات المرتبطة بالورم (TAA) مع تجنب المستويات المنخفضة من تعبير TAA في الأنسجة الطبيعية2.

يتكون بناء CAR بشكل أساسي من خمس مقصورات: ....

Protocol

ملاحظة: تتم جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية مع معطف المختبر والقفازات واتباع تقنيات التعقيم القياسية.

1. توليد CAR التعبير عن Jurkats (CAR-J)

  1. شراء خلايا Jurkat ، استنساخ E6-1 من ATCC. قم بإذابة 1 × 106 خلايا في قارورة T-75 واستزراعها في قوارير T-75. احتفظ بها معلقة عند 0.6 × 106 خلايا لكل مل باستخدام وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المكملة ب 10٪ FBS في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. صفيحة 1 × 105 خلايا جوركات لكل بئر من زراعة الأنسجة عالجت 24 صفيحة بئر في 500 ميكرولتر من وسائط نمو RPMI تحتوي على 4 ميكروغرام / مل بوليبرين مما يعزز كف....

النتائج

تم تقييم نطاق نسبة E: T بين 1: 8 و 8: 1 ل CAR-J1 عند 72 ساعة والتي استهدفت EGFR على خلايا TNBC MDA-MB-231. تم تحويل خلايا Jurkat مع فيروس CAR lentivirus مع البوليبرين لتوليد خلايا CAR-J كما هو موضح في الخطوة 2. زادت السمية الخلوية ل CAR-J1 بشكل ملحوظ مع ارتفاع نسبة E: T مع عدم وجود فرق في القتل بنسبة 1: 8 (الشكل 1). لو.......

Discussion

لقد اقترحنا هنا طريقة سريعة لتقييم النشاط الخلوي الخاص بالهدف الناجم عن تعبير CAR في خلايا Jurkat بكفاءة. جميع تركيبات CAR لها نفس scFv ولكن مجالات مفصلية وغشائية مختلفة ثبت أنها تؤثر على فاعلية الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضداتالوهمية 13. تم إجراء مزيد من التقييم للقتل غير النو?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

كانت MDA-MB-231 هدية كريمة من الدكتور شين ستيكلين. يقر المؤلفون بالتمويل من مركز السرطان بجامعة كانساس لإجراء هذا البحث.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Tube (Sterile)Midwest Scientific#C15BAny similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)Thermo Scientific339652Any similar will work
Black/Clear 96 well plateFalcon353219Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CAny similar will work
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersion 5.3.0.0Any similar will work
Cell Culture IncubatorThermo ScientificHeraCell 160iAny similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)TPP90076Any similar will work
CFSETonbo13-0850-U500Any similar will work
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Any similar will work
DMEMGibco11995-040Any similar will work
FBSGemini bio-products900-108Any similar will work
Flow CytometerCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcAny similar will work
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Company Version 10.7.1Any similar will work
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Any similar will work
GraphPad SoftwareGraphPadVersion 9.3.1 (471)Any similar will work
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
PBSGibco10010-031Any similar will work
PenStrepGibco15070-063Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)Pr1maPR-1250RK-FL, etcAny similar will work
Pipettors Thermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
Propidium IodideInvitrogenP1304MPAny similar will work
RPMICorning10-041-cvAny similar will work
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)Pr1maPR-SERO-25, etcAny similar will work
Sodium PyruvateCorning25-000-CIAny similar will work
Sterile ReservoirsMidwest ScientificRESE-2000Any similar will work
Table top centrifugeEppendorf5810RAny similar will work

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CAR T CAR CAR CAR T CAR Jurkat Lentivirus CAR PBMC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved