형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

요약

단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 종양학의 최전선에 있습니다. CAR은 표적 도메인(일반적으로 단일 사슬 변수 단편, scFv)으로 구성되며, 동반되는 사슬 내 링커와 힌지, 막관통 및 늑골 도메인이 뒤따릅니다. 사슬 내 링커(intra-chain linker)와 힌지 도메인(hinge domain)의 변형은 CAR 매개 사멸에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. CAR 구성의 각 부분에 대한 다양한 옵션을 고려할 때 많은 수의 순열이 있습니다. CAR-T 세포를 만드는 것은 시간과 비용이 많이 드는 공정이며, 많은 구조를 만들고 테스트하는 것은 많은 시간과 재료 투자입니다. 이 프로토콜은 Jurkat 세포(CAR-J)에서 힌지 최적화 CAR 구조를 신속하게 평가하기 위한 플랫폼을 설명합니다. Jurkat 세포는 렌티바이러스 흡수율이 높은 불멸화된 T 세포주로, 효율적인 CAR transduction이 가능합니다. 여기서는 형광 이미저를 사용하여 CAR-J를 신속하게 평가한 후 PBMC 유래 T 세포의 세포 용해를 확인할 수 있는 플랫폼을 제시합니다.

서문

미국 국립암연구소(National Cancer Institute)가 발표한 바에 따르면, CAR-T 세포 치료제는 2017년 이후 FDA가 승인한 6개의 CAR-T 제품에서 분명하게 드러나는 혈액 악성 종양에 대한 큰 가능성을 보여주었습니다¹. 고형 종양을 표적으로 하는 수많은 CAR-T 세포가 임상시험에 참여하고 있습니다. 새로운 CAR 표적을 엔지니어링하고 CAR 구조를 최적화하는 것은 CAR-T 세포의 효능에 매우 중요합니다. 종양 관련 항원(TAA)을 정확하게 표적화하는 동시에 정상 조직에서 낮은 수준의 TAA 발현을 피하기 위해서는 각 응용 분야에 이상적인 CAR 구조를 선택하는 것이 필수적이다².

CAR 구조체는 주로 5개의 구획으로 이루어진다: (1) 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 단일사슬 가변 단편(scFv) 도메인; (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; (4) 세포내 세포질 T 세포 늑골 도메인; 및 (5) 신호 영역. 이러한 각 도메인의 변형은 표적 셀³과 결합하는 CAR-T 셀의 정밀도에 영향을 미칩니다. 따라서 in vitro에서 이러한 CAR 구조체의 세포 독성 및 ....

프로토콜

알림: 모든 세포 배양 작업은 실험실 가운, 장갑 및 표준 무균 기술에 따라 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

1. Jurkats를 발현하는 CAR 생성 (CAR-J)

1. Jurkat 세포를 구입하고 ATCC에서 E6-1을 복제하십시오. T-75 플라스크에서 1 x 10⁶ 세포를 해동하고 T-75 플라스크에서 배양합니다. 5 % CO₂ 의 37 ° C에서 10 % FBS가 보충 된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지를 사용하여 mL 당 0.6 x 10⁶ 세포로 현탁액으로 유지합니다.
2. 플레이트 1 x 10⁵ Jurkat 세포는 렌티바이러스 효율을 향상시키는 4μg/mL 폴리브렌을 함유한 500μL의 RPMI 성장 배지에 처리된 조직 배양 웰당 24웰 플레이트를 처리합니다. 레이저 기반 형광 검출 벤치탑 세포 분석기를 사용하여 세포 계수를 계산합니다. 웰의 수는 평가할 구성의 수에 따라 달라집니다. 이 예제에서는 4개의 구문과 변환되지 않은 컨트롤을 사용합니다. CAR 구조 설계는 표 1에 나타내었다.
3. 각 CAR 구조체의....

토론

여기에서 우리는 Jurkat 세포에서 CAR 발현에 의해 유도된 표적 특이적 세포 용해 활성을 효율적으로 평가할 수 있는 신속한 방법을 제안했습니다. 모든 CAR 구조체는 동일한 scFv를 갖지만 CAR-T 세포 효능에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 힌지 및 막관통 도메인이 다릅니다¹³. 이들 CAR-J에 의한 비특이적 사멸에 대한 추가 평가는 항원 녹아웃(KO) 세포로 배양하여 수행되었습니다. 이는 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work