형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

요약

단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 종양학의 최전선에 있습니다. CAR은 표적 도메인(일반적으로 단일 사슬 변수 단편, scFv)으로 구성되며, 동반되는 사슬 내 링커와 힌지, 막관통 및 늑골 도메인이 뒤따릅니다. 사슬 내 링커(intra-chain linker)와 힌지 도메인(hinge domain)의 변형은 CAR 매개 사멸에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. CAR 구성의 각 부분에 대한 다양한 옵션을 고려할 때 많은 수의 순열이 있습니다. CAR-T 세포를 만드는 것은 시간과 비용이 많이 드는 공정이며, 많은 구조를 만들고 테스트하는 것은 많은 시간과 재료 투자입니다. 이 프로토콜은 Jurkat 세포(CAR-J)에서 힌지 최적화 CAR 구조를 신속하게 평가하기 위한 플랫폼을 설명합니다. Jurkat 세포는 렌티바이러스 흡수율이 높은 불멸화된 T 세포주로, 효율적인 CAR transduction이 가능합니다. 여기서는 형광 이미저를 사용하여 CAR-J를 신속하게 평가한 후 PBMC 유래 T 세포의 세포 용해를 확인할 수 있는 플랫폼을 제시합니다.

서문

미국 국립암연구소(National Cancer Institute)가 발표한 바에 따르면, CAR-T 세포 치료제는 2017년 이후 FDA가 승인한 6개의 CAR-T 제품에서 분명하게 드러나는 혈액 악성 종양에 대한 큰 가능성을 보여주었습니다¹. 고형 종양을 표적으로 하는 수많은 CAR-T 세포가 임상시험에 참여하고 있습니다. 새로운 CAR 표적을 엔지니어링하고 CAR 구조를 최적화하는 것은 CAR-T 세포의 효능에 매우 중요합니다. 종양 관련 항원(TAA)을 정확하게 표적화하는 동시에 정상 조직에서 낮은 수준의 TAA 발현을 피하기 위해서는 각 응용 분야에 이상적인 CAR 구조를 선택하는 것이 필수적이다².

CAR 구조체는 주로 5개의 구획으로 이루어진다: (1) 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 단일사슬 가변 단편(scFv) 도메인; (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; (4) 세포내 세포질 T 세포 늑골 도메인; 및 (5) 신호 영역. 이러한 각 도메인의 변형은 표적 셀³과 결합하는 CAR-T 셀의 정밀도에 영향을 미칩니다. 따라서 in vitro에서 이러한 CAR 구조체의 세포 독성 및 교차 반응성을 평가하는 것은 in vivo 실험을 진행하기 위한 올바른 구조체를 선택하는 데 중요합니다. 현재 T 세포에 의한 세포 분해를 평가하는 방법에는 ⁵¹Cr 방출 분석, 젖산 탈수소효소 방출 분석, 생물 발광 이미징 분석, 실시간 임피던스 기반 세포 분석 및 세포 기반 유세포 분석^{분석 4,5}가 포함됩니다. 여기에 설명된 형광 이미징 기반 플랫폼은 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 식별하며, 이는 T 세포에 의한 세포 용해를 평가하는 간접적인 방법과 달리 T 세포 세포 용해의 직접적인 정량화입니다.

다음은 MDA-MB-231 삼중음성 유방암(TNBC) 세포 및 EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 세포에 대한 표피 성장 인자 수용체(EGFR) CAR을 발현하는 Jurkat 세포의 세포 독성을 평가하기 위한 최소한의 개입으로 쉽고 비용 효율적이며 빠르고 처리량이 높은 기술입니다. 주르캣 세포(Jurkat cell)는 불멸의 인간 T 림프구 세포(human T lymphocyte cell⁾⁶로, T 세포 활성화 및 신호전달 기전을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다⁷. 또한, Jurkat 세포는 여러 연구에서 시험관 내 CAR 테스트에 사용되었습니다 8,9,10,11. Jurkat 세포는 렌티바이러스에 의해 쉽게 transduction되고 지속적인 증식을 가지고 있으며, 이 시스템은 다양한 EGFR CAR 구조의 힌지 도메인을 최적화하는 데 활용되었습니다.

이 분석법은 다양한 종양 항원을 표적으로 하는 여러 CAR 구조체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며 여러 부착 종양 세포주 및 다양한 이펙터 대 종양(E:T) 비율에 사용할 수 있습니다. 또한 여러 시점을 평가할 수 있으며 반복실험 횟수를 수정하여 다양한 CAR 구성 중에서 최상의 사멸을 식별할 수 있습니다. 최상의 구성물은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 유래 CD3 T 세포를 사용하여 확인해야 합니다. 이 방법 개발의 전반적인 목표는 낮은 형질도입 효율과 같은 장벽을 극복하고 PBMC 유래 T 세포를 확인하는 고처리량 방식으로 CAR 힌지 형상을 신속하게 최적화하는 것입니다.

프로토콜

알림: 모든 세포 배양 작업은 실험실 가운, 장갑 및 표준 무균 기술에 따라 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

1. Jurkats를 발현하는 CAR 생성 (CAR-J)

1. Jurkat 세포를 구입하고 ATCC에서 E6-1을 복제하십시오. T-75 플라스크에서 1 x 10⁶ 세포를 해동하고 T-75 플라스크에서 배양합니다. 5 % CO₂ 의 37 ° C에서 10 % FBS가 보충 된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지를 사용하여 mL 당 0.6 x 10⁶ 세포로 현탁액으로 유지합니다.
2. 플레이트 1 x 10⁵ Jurkat 세포는 렌티바이러스 효율을 향상시키는 4μg/mL 폴리브렌을 함유한 500μL의 RPMI 성장 배지에 처리된 조직 배양 웰당 24웰 플레이트를 처리합니다. 레이저 기반 형광 검출 벤치탑 세포 분석기를 사용하여 세포 계수를 계산합니다. 웰의 수는 평가할 구성의 수에 따라 달라집니다. 이 예제에서는 4개의 구문과 변환되지 않은 컨트롤을 사용합니다. CAR 구조 설계는 표 1에 나타내었다.
3. 각 CAR 구조체의 렌티바이러스/웰 10μL를 추가합니다. CAR 구축물 설계 및 렌티바이러스 생산은 앞서 설명한 바와 같이 수행하였다¹².
4. 다음날 각 웰에 1mL의 성장 RPMI 배지를 추가하고 5 % CO₂ 로 37 ° C의 인큐베이터에서 계속 배양합니다.
5. 2일 후(Jurkat 형질도입 후 총 72시간) 세포를 수집하고 계수합니다.
6. Jurkat 세포에서 CAR 발현을 확인하기 위해 1 x 10⁴ 세포를 흐름 흐름에 사용합니다. 간단히 말해서, 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 CAR 양성을 검출하는 데 사용되는 플래그 태그를 표적으로 하는 항체로 CAR-J를 라벨링하기 전에 FACS 염색액(FSS)으로 세포를 2배 세척합니다. FSS로 다시 2회 세척하고 앞서 설명한 대로 유세포 분석기를 통해 세포를 실행합니다¹². 제조업체에서 권장하는 항체 농도를 사용하십시오.
7. Jurkat 세포는 쉽게 transduction되며 거의 항상 >90%의 CAR 발현을 보입니다. CAR-J는 공동 배양 세포독성 분석보다 훨씬 앞서 생산하고 나중에 사용할 수 있도록 냉동합니다.

2. CFSE 표지 종양 세포 도금

참고: MDA-MB-231(ATCC, HTB-26) 세포는 공동 연구자의 선물이며, EGFR KO MDA-MB-231은 앞서 설명한 바와 같이 생성되었습니다¹².

1. T-75 플라스크에서 1 x 10⁶ 세포를 해동하고 T-75 플라스크에서 배양합니다. MDA-MB-231 종양 세포와 CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 종양 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 14mL에 5%_CO2 가 있는 37°C의 인큐베이터에서 유지하고 약 70%가 합류하면 분할합니다.
2. 일반 명시야 현미경으로 부착 종양 세포를 관찰하여 거의 70%의 합류도를 확인합니다.
3. 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. T75 플라스크에 트립신 3mL를 넣고 37°C의 인큐베이터에 5%_CO2 와 함께 3-5분 동안 넣어 플라스크에서 세포를 분리합니다.
4. 동일한 양(3mL)의 성장 배지를 사용하여 트립신을 중화합니다. 원심분리기 튜브에 세포 현탁액을 모으고 400 x g 에서 4분 동안 세포를 회전시켜 세포를 펠릿 아래로 떨어뜨립니다.
5. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 세포를 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다. 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.
6. 8 x 10⁵ 세포를 다른 15mL 튜브에 옮기고 PBS를 추가하여 부피가 1mL가 되도록 합니다.
7. 2μL의 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE, 5μM 원액 농도)를 각 튜브에 넣고 1mL 피펫을 사용하여 잘 혼합합니다.
8. 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % CO 2 로 20 분 동안 CFSE로 세포를 배양_합니다. 20분 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 5mL의 성장 배지를 튜브에 추가합니다.
9. 튜브를 400 x g 에서 4분 동안 원심분리하여 CFSE 라벨이 부착된 세포를 펠릿 아래로 펠릿화합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 1mL의 새 배지를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.
10. 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 재평가합니다. 4 x 10⁵ 세포를 25mL 시약 reservoir에 옮기고 배지를 추가하여 총 부피 8mL를 만듭니다.
    1. 100μL의 배지에 5000개의 종양 세포/웰을 파종할 수 있는 충분한 부피를 확보하려면 멀티채널 피펫을 사용하여 피펫팅할 수 있어야 하며, 1.7단계 동안 일부 세포의 손실을 보상하기 위해 10%-20%의 추가 세포와 배지 부피를 준비해야 합니다.
11. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 완전히 혼합합니다. 100 μL 멀티채널 피펫을 사용하여 100 μL의 셀 현탁액을 왼쪽 절반에 있는 투명하고 평평한 바닥 검은색 96웰 플레이트의 각 열에 피펫팅합니다. 샘플 도금 전략은 표 2에서 찾을 수 있습니다.
12. 피펫 EGFR KO 세포는 플레이트의 오른쪽 절반에 유사하게 있습니다. 전체 플레이트가 도금되면 조직 배양 후드 플랫폼에서 플레이트를 앞뒤로 좌우로 끌어 웰에 종양 세포가 균일하게 분포되도록 합니다.
13. 종양 세포가 부착할 수 있도록 37°C의 인큐베이터에서 5%_CO2 로 플레이트를 4시간 동안 배양합니다.

3. CFSE 표지 종양 세포와 Jurkat을 발현하는 CAR의 공동 배양

1. transduction되지 않은 세포 및 CAR 발현 Jurkat 세포의 수를 사용하여 각 CAR-J의 4 x 10⁵ 세포를 25mL reservoir로 전달합니다. 총 부피 2mL의 DMEM 성장 배지를 추가합니다.
2. 4:1의 E:T의 경우, 부착된 종양 세포를 방해하지 않도록 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 배지에 웰당^{2 x 10 4} CAR-J를 첨가하여 각 웰의 측면을 따라 부드럽게 첨가했습니다.
3. 종양 세포와 Jurkat 세포가 들어 있는 웰 측면에 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 성장 배지를 추가합니다. 종양 그룹만 200μL의 배지를 얻어 모든 웰에서 총 300μL의 배지를 만듭니다.
4. 플랫폼을 따라 플레이트를 앞뒤로 그리고 좌우로 드래그하여 종양 세포에 Jurkat 세포가 균일하게 분포되도록 합니다.
5. 37°C의 인큐베이터에서 5% CO₂ 로 48시간 동안 공동 배양합니다.

4. 이미징을 위한 플레이트 준비

1. 웰 수에 따라 낮은 백그라운드 형광 매체에서 1μg/mL의 프로피듐 요오드화물(PI) 용액을 만들고 각각 100μL의 매체를 얻습니다.
2. 84웰의 경우 PI가 포함된 배지 9mL를 준비합니다. 피펫을 사용하여 매체를 완전히 혼합합니다.
3. Triton-X를 탈이온수로 희석하여 20% Triton-X 용액 10mL를 만듭니다. 48시간의 공동 배양 후 CAR-J가 포함된 상층액을 플레이트를 한 번 뒤집고 종이 타월을 두드려 버립니다.
4. 이제 부착된 종양 세포를 방해하지 않도록 멀티채널 피펫을 사용하여 PI가 포함된 위의 준비된 배지 100μL(4.2단계)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.
5. 20μL의 20% Triton-X 용액을 각 종양 유형의 첫 번째 웰에 추가하여 전체 데드 컨트롤 기능을 합니다.
6. 플레이트를 인큐베이터에 20분 동안 그대로 둡니다. 형광 이미징 세포분석기를 사용하여 플레이트를 이미지화합니다. 데이터는 컴퓨터에 저장되며 나중에 분석할 수 있습니다.

5. 형광 이미지 분석

1. 녹색 형광 채널을 설정하기 위해 세포의 종양 중 하나를 사용하십시오.
2. 웰 마스크를 98%로 줄여 웰 가장자리의 셀을 제거하는데, 이는 신호가 가장자리에서 완벽하지 않기 때문입니다.
3. 녹색 형광 CFSE 채널에서 CFSE 표지 종양 세포를 식별합니다. 형광 강도 임계값을 수정하여 웰의 모든 세포를 선택합니다.
4. 최소 셀 직경을 25μm로 설정하여 CFSE 채널에서 감지된 파편을 제거합니다. 이는 분석되는 세포 유형에 따라 다릅니다.
5. Separate Touching Objects를 활성화하여 서로 접촉할 때 개별 셀을 식별합니다.
6. 이미지 디스플레이에서 CFSE 를 선택하고 그래픽 오버레이를 확인하여 시스템에서 무엇을 선택하는지 파악합니다.
7. CFSE 표지된 세포가 제대로 픽업되면 살아있는 세포와 죽은 세포 집단을 정의하기 위해 게이트를 설정합니다.
8. CFSE 라벨이 부착된 셀을 선택하여 y축의 카운트 대 x축의 평균 PI 강도에 대한 히스토그램을 생성합니다.
9. Triton-X를 추가한 웰(단계 4.5)을 기반으로 스플리터를 그려 PI 염색이 낮은 세포와 PI 염색이 높은 세포를 구별합니다. 이 웰에는 PI가 많이 염색된 영역에 대부분의 세포가 있어야 합니다.
   참고: PI는 살아있는 세포의 기초 신호를 보여줍니다. 따라서 Triton-X를 추가하면 모든 세포가 죽고 적색 형광 채널에서 밝게 염색됩니다. 이것은 살아있는 세포에서 죽은 세포를 분리하기 위해 게이트를 쉽게 그릴 수 있습니다.
10. 셀을 더 잘 볼 수 있도록 x축 값을 조정합니다. 이제 PI가 낮은 염색된 세포를 살아있는 세포로 라벨링합니다.
11. 라이브 셀을 선택하고 x축에 area가 있고 y축에 count가 있는 다른 히스토그램을 설정합니다.
12. 파편이 아닌 세포를 포획하기 위해 종양만 사용하여 다른 스플리터를 그립니다. Jurkat 처리된 우물은 CFSE로 얼룩지고 카운트에서 제거해야 하는 파편을 축적하기 시작합니다. 나머지 비파편은 "큰 세포"로 표시됩니다.
13. 전체 플레이트에서 해석을 실행하고 숫자가 포함된 스프레드시트를 내보냅니다.
14. CAR-J에 노출된 후 웰에 남아 있는 살아있는 CFSE 표지 종양 세포의 수를 식별하기 위해 빅 카운트를 플로팅합니다. 일원분산분석을 사용하여 통계량을 결정합니다.

결과

CAR-J1에 대한 1:8 및 8:1 사이의 E:T 비율 범위는 TNBC MDA-MB-231 세포에서 EGFR을 표적으로 하는 72시간에 평가되었습니다. jurkat 세포를 폴리브렌이 포함된 CAR 렌티바이러스로 형질도입하여 단계 2에 설명된 대로 CAR-J 세포를 생성했습니다. CAR-J1의 세포독성은 E:T 비율이 높을수록 유의하게 증가했으며, 1:8 비율에서 사멸 차이는 없었습니다(그림 1). 72시간 동안 4:1 E:T에서 50% 이상의 사...

토론

여기에서 우리는 Jurkat 세포에서 CAR 발현에 의해 유도된 표적 특이적 세포 용해 활성을 효율적으로 평가할 수 있는 신속한 방법을 제안했습니다. 모든 CAR 구조체는 동일한 scFv를 갖지만 CAR-T 세포 효능에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 힌지 및 막관통 도메인이 다릅니다¹³. 이들 CAR-J에 의한 비특이적 사멸에 대한 추가 평가는 항원 녹아웃(KO) 세포로 배양하여 수행되었습니다. 이는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work