Avaliação Rápida da Citotoxicidade In Vitro do Receptor de Antígeno Quimérico Jurkat Expressando Usando Imagem Fluorescente

Resumo

Um protocolo para avaliar a morte quantitativa de células tumorais por células Jurkat expressando receptor de antígeno quimérico (CAR) visando antígeno único tumoral. Este protocolo pode ser usado como uma plataforma de triagem para otimização rápida de construções de dobradiças CAR antes da confirmação em células T derivadas do sangue periférico.

Resumo

As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) estão na vanguarda da oncologia. Um CAR é construído de um domínio de alvo (geralmente um fragmento variável de cadeia única, scFv), com um elo intra-cadeia que o acompanha, seguido por uma dobradiça, transmembrana e domínio costimulatório. A modificação do domínio do elo intra-cadeia e da dobradiça pode ter um efeito significativo na matança mediada pelo CAR. Considerando as muitas opções diferentes para cada parte de uma construção CAR, há um grande número de permutações. Fazer células CAR-T é um processo demorado e caro, e fazer e testar muitas construções é um investimento pesado de tempo e material. Este protocolo descreve uma plataforma para avaliar rapidamente construções CAR otimizadas para dobradiças em células Jurkat (CAR-J). As células Jurkat são uma linhagem de células T imortalizadas com alta captação de lentivírus, permitindo uma transdução eficiente de CAR. Aqui, apresentamos uma plataforma para avaliar rapidamente o CAR-J usando um imageador fluorescente, seguido pela confirmação de citólise em células T derivadas do PBMC.

Introdução

A terapia celular CAR-T tem se mostrado uma grande promessa em neoplasias hematológicas, evidente a partir dos 6 produtos CAR-T aprovados pela FDA desde 2017, conforme relatado pelo Instituto Nacional do Câncer¹. Existem numerosas células CAR-T em ensaios clínicos para atingir tumores sólidos. A engenharia de novos alvos CAR e a otimização da construção do CAR são vitais para a eficácia de uma célula CAR-T. A escolha da construção CAR ideal para cada aplicação é essencial para o direcionamento preciso de antígenos associados ao tumor (TAA), evitando baixos níveis de expressão de TAA em tecidos normais².

Uma construção CAR é feita principalmente de cinco compartimentos: (1) domínio de fragmento variável de cadeia única extracelular (scFv) visando antígeno tumoral; (2) domínio da dobradiça; (3) domínio transmembrana; (4) domínio costimulatório de células T citoplasmáticas intracelulares; e (5) domínio da sinalização. A modificação de cada um desses domínios afeta a precisão do envolvimento da célula CAR-T com sua célula-alvo³. Assim, avaliar a citotoxicidade e a reatividade cruzada desses construtos CAR in vitro é fundamental para escolher o construto certo para progredir em direção a experimentos in vivo. Os métodos atuais de avaliação da citólise por células T incluem ensaio de liberação de ⁵¹Cr, ensaio de liberação de lactato desidrogenase, ensaio de imagem bioluminescente, análise celular baseada em impedância em tempo real e ensaio de citometria de fluxo baseado em células ^4,5. A plataforma baseada em imagem fluorescente descrita aqui identifica o número de células vivas versus mortas, que é uma quantificação direta da citólise de células T em oposição a um método indireto de avaliação da citólise por células T.

Aqui está uma técnica fácil, econômica, rápida e de alto rendimento com intervenção mínima para avaliar a citotoxicidade de células Jurkat expressando o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) CAR contra células de câncer de mama triplo-negativo (TNBC) MDA-MB-231 e células EGFR CRISPR nocautear células MDA-MB-231. As células Jurkat são células de linfócitos T humanos imortalizadas⁶ que têm sido amplamente utilizadas para estudar os mecanismos de ativação e sinalização das células T⁷. Além disso, células Jurkat têm sido utilizadas para testes in vitro de CAR em múltiplos estudos 8,9,10,11. As células de Jurkat são facilmente transduzidas por lentivírus e têm proliferação sustentada, e este sistema foi aproveitado para otimizar o domínio da dobradiça de várias construções EGFR CAR.

Este ensaio pode ser usado para rastrear múltiplas construções CAR visando vários antígenos tumorais e usado contra múltiplas linhagens de células tumorais aderentes e em várias relações efetor para tumor (E:T). Além disso, vários pontos de tempo podem ser avaliados, e o número de réplicas pode ser modificado para identificar a melhor matança entre as várias construções do CAR. Os melhores construtos precisam ser confirmados usando células T CD3 derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). O objetivo geral por trás do desenvolvimento deste método é otimizar rapidamente a geometria da dobradiça CAR de uma maneira de alto rendimento, superando barreiras como baixa eficiência de transdução, seguida de confirmação em células T derivadas do PBMC.

Protocolo

NOTA: Todo o trabalho de cultura de células é feito em um gabinete de biossegurança com jaleco, luvas e seguindo técnicas assépticas padrão.

1. Gerando CAR expressando Jurkats (CAR-J)

1. Compre células Jurkat, clone E6-1 da ATCC. Descongelar 1 x 10⁶ células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Mantê-los em suspensão a 0,6 x 10⁶ células por mL usando o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com FBS a 10% em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Placa 1 x 10⁵ células Jurkat por poço de uma cultura de tecidos tratada placa de 24 poços em 500 μL de meio de crescimento RPMI contendo 4 μg/mL de polibreno que aumenta a eficiência lentiviral. Conte células usando um analisador de células de bancada de detecção fluorescente baseado em laser. O número de poços depende do número de construtos a serem avaliados. Este exemplo usará 4 construções e um controle não transduzido. O desenho do construto CAR é mostrado na Tabela 1.
3. Adicionar 10 μL de lentivírus/poço de cada construção CAR. O projeto de construção do CAR e a produção de lentivírus foram feitos conforme descrito anteriormente¹².
4. No dia seguinte, adicionar 1 mL de meio RPMI de crescimento a cada poço e continuar a cultura na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
5. Coletar células 2 dias depois (total de 72 h após a transdução de Jurkat) e contá-las.
6. Tome 1 x 10⁴ células para fluxo de corrida para confirmar a expressão CAR nas células Jurkat. Resumidamente, lave as células 2x com solução de coloração FACS (FSS) antes de rotular o CAR-J com anticorpos direcionados à etiqueta Flag usada para detectar positividade de CAR por 30 minutos no escuro a 4 °C. Lavar novamente 2x com FSS e passar as células através de um citômetro de fluxo como descrito anteriormente¹². Use a concentração de anticorpos conforme recomendado pelo fabricante.
7. As células Jurkat são facilmente transduzidas e quase sempre apresentam expressão >90% do CAR. Produzir CAR-J muito antes do ensaio de citotoxicidade da co-cultura e congelar para uso posterior.

2. Plating CFSE células tumorais marcadas

NOTA: AS CÉLULAS MDA-MB-231 (da ATCC, HTB-26) foram um presente de um colaborador, e EGFR KO MDA-MB-231 foram criadas conforme descrito anteriormente¹².

1. Descongelar 1 x 10⁶ células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Manter células tumorais MDA-MB-231 e células tumorais CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 em 14 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ e dividido quando aproximadamente 70% confluente.
2. Observe células tumorais aderentes sob microscópio de campo claro regular para garantir quase 70% de confluência.
3. Retirar o meio de crescimento do frasco com uma pipeta serológica. Adicionar 3 ml de tripsina ao balão T75 e colocar numa estufa a 37 °C com CO₂ a 5% durante 3-5 minutos para separar as células do balão.
4. Neutralizar a tripsina utilizando igual quantidade (3 mL) de meio de crescimento. Recolher a suspensão celular num tubo de centrifugação e girar as células a 400 x g durante 4 minutos para peletizar as células.
5. Descarte o sobrenadante com pipeta e ressuspenda as células em 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Determine a concentração celular usando um contador de células.
6. Transfira 8 x 10⁵ células para outro tubo de 15 mL e adicione PBS para chegar a um volume de 1 mL.
7. Adicionar 2 μL de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE; concentração de estoque de 5 μM) em cada tubo e misturar bem usando uma pipeta de 1 mL.
8. Incubar as células com CFSE durante 20 min na estufa a 37 °C com 5% de CO₂. Retire os tubos da incubadora após 20 min e adicione 5 mL de meio de crescimento ao tubo.
9. Centrifugar os tubos a 400 x g por 4 min para pelar as células marcadas com CFSE. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta e adicionar 1 ml de meio fresco para ressuspender as células.
10. Reavalie a concentração celular usando um contador de células. Transfira 4 x 10⁵ células para um reservatório de reagente de 25 mL e adicione meios para um volume total de 8 mL.
    1. Para garantir volume suficiente para semear 5000 células tumorais/poço em 100 μL de meio, o volume necessário para ser capaz de pipetar usando a pipeta multicanal, e para compensar a perda de algumas células durante a etapa 1.7, preparar 10%-20% de células extras e volume de meio.
11. Misturar bem a suspensão celular com uma pipeta serológica de 5 ml. Usando uma pipeta multicanal de 100 μL, pipete 100 μL da suspensão celular em cada fileira da placa preta preta de fundo plano transparente de 96 poços na metade esquerda. Uma estratégia de plaqueamento amostral pode ser encontrada na Tabela 2.
12. Pipetar células EGFR KO de forma semelhante na metade direita da placa. Uma vez que toda a placa é plaqueada, arraste a placa para frente e para trás e de um lado para o outro na plataforma da capela de cultura de tecidos para garantir uma distribuição uniforme das células tumorais nos poços.
13. Incubar a placa durante 4 h na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ para que as células tumorais se fixem.

3. Co-cultivo de CAR expressando Jurkats com células tumorais marcadas com CFSE

1. Usando as contagens de células Jurkat não transduzidas e CAR expressando, transfira 4 x 10⁵ células de cada CAR-J para um reservatório de 25 mL. Adicionar meio de crescimento DMEM para um volume total de 2 mL.
2. Para E:T de 4:1, 2 x 10⁴ CAR-J foram adicionados por poço em 100 μL de meio usando uma pipeta multicanal suavemente ao longo da lateral de cada poço para não perturbar as células tumorais aderidas.
3. Adicione mais 100 μL de meio de crescimento usando uma pipeta multicanal ao lado de poços contendo células tumorais e células Jurkat. Os grupos tumorais recebem apenas 200 μL de meio para totalizar 300 μL de meio em todos os poços.
4. Arraste a placa ao longo da plataforma em movimento para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir uma distribuição uniforme das células de Jurkat nas células tumorais.
5. Permitir a cocultura na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante 48 h.

4. Preparo da placa para aquisição de imagens

1. Fazer uma solução de iodeto de propídio (PI) a 1 μg/mL em meios de fluorescência de fundo baixo com base no número de poços e cada um obtendo 100 μL de meio.
2. Para 84 poços preparar 9 mL de meio contendo IP. Misture bem a mídia usando uma pipeta.
3. Completar 10 ml de solução de Triton-X a 20% diluindo Triton-X com água deionizada. Após 48 h de cultivo de co, descarte o sobrenadante contendo CAR-J por uma única inversão da placa e toque em papel toalha.
4. Agora adicione 100 μL do meio preparado acima (passo 4.2) contendo IP em cada poço usando uma pipeta multicanal suavemente para não perturbar as células tumorais aderidas.
5. Adicionar 20 μL de solução de Triton-X a 20% ao primeiro poço de cada tipo de tumor que funcione como um controle morto total.
6. Deixe a placa na incubadora por 20 min. Imagem da placa usando o citômetro de imagem fluorescente. Os dados são armazenados no computador e podem ser analisados posteriormente.

5. Análise de imagens fluorescentes

1. Use um dos tumores apenas bem de células para definir o canal verde fluorescente.
2. Diminua a máscara do poço para 98% para remover as células na borda do poço, pois o sinal não é perfeito na borda.
3. Identificar células tumorais marcadas com CFSE no canal CFSE verde e fluorescente. Modifique o valor limite de intensidade de fluorescência para captar todas as células do poço.
4. Defina o diâmetro mínimo da célula para 25 μm para remover quaisquer detritos detectados no canal CFSE. Isso varia de acordo com o tipo de célula analisada.
5. Habilite Objetos de toque separados para identificar células individuais quando estiverem em contato umas com as outras.
6. Selecione CFSE na exibição da imagem e observe a sobreposição gráfica para descobrir o que está sendo escolhido pelo sistema.
7. Uma vez que as células marcadas com CFSE estão sendo adequadamente captadas, estabeleça portas para definir a população de células vivas versus mortas.
8. Selecionando as células marcadas com CFSE, gere um histograma de contagens no eixo y versus intensidade média do IP no eixo x.
9. Com base no poço onde adicionamos Triton-X (passo 4.5), desenhe um divisor para diferenciar células coradas com baixo IP versus células coradas com alto PI. Este poço deve ter a maioria das células em uma região corada por PI alto.
   NOTA: O PI mostra o sinal basal em células vivas. Assim, a adição de Triton-X mata todas as células e elas ficam brilhantes no canal fluorescente vermelho. Isso facilita o desenho de portas para separar células mortas de células vivas.
10. Ajuste o valor do eixo x para poder visualizar melhor as células. Agora rotule as células coradas com baixo IP como células vivas.
11. Selecionando as células vivas, defina outro histograma com área no eixo x e conte no eixo y.
12. Desenhe outro divisor usando o tumor apenas bem para capturar células e não detritos. Os poços tratados com Jurkat começarão a acumular detritos que serão manchados e precisarão ser removidos das contagens. Os restantes não detritos são rotulados como "células grandes".
13. Execute a análise em toda a chapa e exporte a planilha contendo os números.
14. Plotar as contagens de Big para identificar o número de células tumorais vivas marcadas com CFSE remanescentes no poço após a exposição ao CAR-J. Determine estatísticas usando ANOVA unidirecional.

Resultados

Uma faixa de relação E:T entre 1:8 e 8:1 para CAR-J1 foi avaliada em 72 h que teve como alvo EGFR em células TNBC MDA-MB-231. As células Jurkat foram transduzidas com lentivírus CAR com polibreno para gerar células CAR-J conforme descrito na etapa 2. A citotoxicidade do CAR-J1 aumentou significativamente com maior relação E:T, sem diferença na morte na proporção de 1:8 (Figura 1). Mais de 50% de mortes foram observadas às 4:1 E:T ao longo de 72 h. Este E:T foi usado para experime...

Discussão

Aqui nós propusemos um método rápido para avaliar eficientemente a atividade citolítica alvo-específica induzida pela expressão de CAR em células Jurkat. Todas as construções CAR têm o mesmo scFv, mas diferentes domínios de dobradiça e transmembrana que demonstraram afetar a potência das células CAR-T¹³. Uma avaliação mais aprofundada da morte inespecífica por esses CAR-J foi feita cultivando-os com células de nocaute de antígeno (KO). Isso demonstra que a morte é antígeno tum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work