Avaliação Rápida da Citotoxicidade In Vitro do Receptor de Antígeno Quimérico Jurkat Expressando Usando Imagem Fluorescente

Resumo

Um protocolo para avaliar a morte quantitativa de células tumorais por células Jurkat expressando receptor de antígeno quimérico (CAR) visando antígeno único tumoral. Este protocolo pode ser usado como uma plataforma de triagem para otimização rápida de construções de dobradiças CAR antes da confirmação em células T derivadas do sangue periférico.

Resumo

As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) estão na vanguarda da oncologia. Um CAR é construído de um domínio de alvo (geralmente um fragmento variável de cadeia única, scFv), com um elo intra-cadeia que o acompanha, seguido por uma dobradiça, transmembrana e domínio costimulatório. A modificação do domínio do elo intra-cadeia e da dobradiça pode ter um efeito significativo na matança mediada pelo CAR. Considerando as muitas opções diferentes para cada parte de uma construção CAR, há um grande número de permutações. Fazer células CAR-T é um processo demorado e caro, e fazer e testar muitas construções é um investimento pesado de tempo e material. Este protocolo descreve uma plataforma para avaliar rapidamente construções CAR otimizadas para dobradiças em células Jurkat (CAR-J). As células Jurkat são uma linhagem de células T imortalizadas com alta captação de lentivírus, permitindo uma transdução eficiente de CAR. Aqui, apresentamos uma plataforma para avaliar rapidamente o CAR-J usando um imageador fluorescente, seguido pela confirmação de citólise em células T derivadas do PBMC.

Introdução

A terapia celular CAR-T tem se mostrado uma grande promessa em neoplasias hematológicas, evidente a partir dos 6 produtos CAR-T aprovados pela FDA desde 2017, conforme relatado pelo Instituto Nacional do Câncer¹. Existem numerosas células CAR-T em ensaios clínicos para atingir tumores sólidos. A engenharia de novos alvos CAR e a otimização da construção do CAR são vitais para a eficácia de uma célula CAR-T. A escolha da construção CAR ideal para cada aplicação é essencial para o direcionamento preciso de antígenos associados ao tumor (TAA), evitando baixos níveis de expressão de TAA em tecidos normais².

Protocolo

NOTA: Todo o trabalho de cultura de células é feito em um gabinete de biossegurança com jaleco, luvas e seguindo técnicas assépticas padrão.

1. Gerando CAR expressando Jurkats (CAR-J)

1. Compre células Jurkat, clone E6-1 da ATCC. Descongelar 1 x 10⁶ células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Mantê-los em suspensão a 0,6 x 10⁶ células por mL usando o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com FBS a 10% em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Placa 1 x 10⁵ células Jurkat por poço de uma cultura de tecidos tratada placa de 24 poços em 50....

Discussão

Aqui nós propusemos um método rápido para avaliar eficientemente a atividade citolítica alvo-específica induzida pela expressão de CAR em células Jurkat. Todas as construções CAR têm o mesmo scFv, mas diferentes domínios de dobradiça e transmembrana que demonstraram afetar a potência das células CAR-T¹³. Uma avaliação mais aprofundada da morte inespecífica por esses CAR-J foi feita cultivando-os com células de nocaute de antígeno (KO). Isso demonstra que a morte é antígeno tum.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work