Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente

Résumé

Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.

Résumé

Les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont à l’avant-garde de l’oncologie. Un CAR est constitué d’un domaine de ciblage (généralement un fragment variable à chaîne unique, scFv), accompagné d’un linker intra-chaîne, suivi d’une charnière, d’une membrane et d’un domaine costimulateur. La modification du domaine de liaison intra-chaîne et de charnière peut avoir un effet significatif sur la destruction médiée par le CAR. Compte tenu des nombreuses options différentes pour chaque partie d’une construction CAR, il existe un grand nombre de permutations. La fabrication de cellules CAR-T est un processus long et coûteux, et la fabrication et le test de nombreuses constructions représentent un investissement important en temps et en matériel. Ce protocole décrit une plate-forme permettant d’évaluer rapidement les constructions CAR optimisées pour les charnières dans les cellules Jurkat (CAR-J). Les cellules Jurkat sont une lignée de lymphocytes T immortalisée avec une absorption élevée des lentivirus, permettant une transduction efficace du CAR. Nous présentons ici une plate-forme permettant d’évaluer rapidement CAR-J à l’aide d’un imageur fluorescent, suivie d’une confirmation de la cytolyse dans les lymphocytes T dérivés de PBMC.

Introduction

La thérapie cellulaire CAR-T s’est révélée très prometteuse dans les hémopathies malignes, comme en témoignent les 6 produits CAR-T approuvés par la FDA depuis 2017, comme l’a rapporté le National Cancer Institute¹. Il existe de nombreuses cellules CAR-T dans les essais cliniques pour cibler les tumeurs solides. L’ingénierie de nouvelles cibles CAR et l’optimisation de la construction CAR sont essentielles à l’efficacité d’une cellule CAR-T. Le choix de la construction CAR idéale pour chaque application est essentiel pour cibler avec précision les antigènes associés à la tumeur (TAA) tout en évitant de faibles niveaux d’expression de TAA dans les tissus normaux².

Une construction CAR est principalement constituée de cinq compartiments : (1) le domaine extracellulaire à fragment variable à chaîne unique (scFv) ciblant l’antigène tumoral ; (2) domaine de charnière ; (3) domaine transmembranaire ; (4) domaine costimulateur des lymphocytes T cytoplasmiques intracellulaires ; et (5) domaine de signalisation. La modification de chacun de ces domaines affecte la précision de l’engagement de la cellule CAR-T avec sa cellule cible³. Par conséquent, l’évaluation de la cytotoxicité et de la réactivité croisée de ces constructions CAR in vitro est essentielle pour choisir la bonne construction pour progresser vers des expériences in vivo. Les méthodes actuelles d’évaluation de la cytolyse par les lymphocytes T comprennent le test de libération de ⁵¹Cr, le test de libération de lactate déshydrogénase, le test d’imagerie bioluminescente, l’analyse cellulaire basée sur l’impédance en temps réel et le test de cytométrie en flux cellulaire ^4,5. La plate-forme d’imagerie fluorescente décrite ici identifie le nombre de cellules vivantes par rapport aux cellules mortes, ce qui est une quantification directe de la cytolyse des lymphocytes T par opposition à une méthode indirecte d’évaluation de la cytolyse par les lymphocytes T.

Voici une technique simple, rentable, rapide et à haut débit avec une intervention minimale pour évaluer la cytotoxicité des cellules de Jurkat exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) CAR contre les cellules de cancer du sein triple négatif (TNBC) MDA-MB-231 et les cellules EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231. Les cellules Jurkat sont des lymphocytes T humains immortalisés⁶ qui ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes d’activation et de signalisation des lymphocytes T⁷. De plus, les cellules de Jurkat ont été utilisées pour des tests in vitro de CAR dans de multiples études 8,9,10,11. Les cellules de Jurkat sont facilement transduites par les lentivirus et ont une prolifération soutenue, et ce système a été exploité pour optimiser le domaine charnière de diverses constructions EGFR CAR.

Ce test peut être utilisé pour le criblage de plusieurs constructions CAR ciblant divers antigènes tumoraux et utilisé contre plusieurs lignées cellulaires tumorales adhérentes et dans divers rapports effecteur/tumeur (E :T). De plus, plusieurs points temporels peuvent être évalués et le nombre de répétitions peut être modifié pour identifier le meilleur abattage parmi les différentes constructions de CAR. Les meilleures constructions doivent être confirmées à l’aide de cellules T CD3 dérivées de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). L’objectif global derrière le développement de cette méthode est d’optimiser rapidement la géométrie de la charnière CAR à haut débit en surmontant des obstacles tels qu’une faible efficacité de transduction, suivie d’une confirmation dans les cellules T dérivées de PBMC.

Protocole

REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire sont effectués dans une enceinte de sécurité biologique avec une blouse de laboratoire, des gants et en suivant les techniques aseptiques standard.

1. Génération de Jurkats exprimant le CAR (CAR-J)

1. Achetez des cellules Jurkat, clonez E6-1 auprès d’ATCC. Décongeler 1 x 10⁶ cellules dans une fiole T-75 et les cultiver dans des fioles T-75. Maintenez-les en suspension à raison de 0,6 x 10⁶ cellules par ml à l’aide d’un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de FBS dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Plaque 1 x 10⁵ cellules de Jurkat par puits d’une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire dans 500 μL de milieu de culture RPMI contenant 4 μg/mL de polybrène qui améliore l’efficacité lentivirale. Comptez les cellules à l’aide d’un analyseur de cellules de paillasse à détection fluorescente à base de laser. Le nombre de puits dépend du nombre de constructions à évaluer. Cet exemple utilisera 4 constructions et un contrôle non transduit. Le tableau 1 présente la conception de la construction du RAC.
3. Ajouter 10 μL de lentivirus/puits de chaque construction de CAR. La conception de la construction du CAR et la production de lentivirus ont été effectuées comme décrit précédemment¹².
4. Le lendemain, ajouter 1 mL de milieu de croissance RPMI dans chaque puits et poursuivre la culture dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
5. Prélevez les cellules 2 jours plus tard (total 72 h après la transduction de Jurkat) et comptez-les.
6. Prenez 1 x 10⁴ cellules pour l’écoulement afin de confirmer l’expression de CAR sur les cellules de Jurkat. Brièvement, lavez les cellules 2 fois avec une solution de coloration FACS (FSS) avant de marquer le CAR-J avec des anticorps ciblant la balise Flag utilisée pour détecter la positivité CAR pendant 30 minutes dans l’obscurité à 4 °C. Laver à nouveau 2 fois avec FSS et faire passer les cellules dans un cytomètre en flux comme décrit précédemment¹². Utilisez la concentration d’anticorps recommandée par le fabricant.
7. Les cellules de Jurkat sont facilement transductibles et présentent presque toujours >90% d’expression de CAR. Produire du CAR-J longtemps avant l’essai de cytotoxicité en coculture et le congeler pour une utilisation ultérieure.

2. Placage des cellules tumorales marquées CFSE

NOTE : LES CELLULES MDA-MB-231 (de l’ATCC, HTB-26) ont été offertes par un collaborateur, et les cellules EGFR KO MDA-MB-231 ont été créées comme décrit précédemment¹².

1. Décongeler 1 x 10⁶ cellules dans une fiole T-75 et les cultiver dans des fioles T-75. Maintenir les cellules tumorales MDA-MB-231 et les cellules tumorales CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 dans 14 mL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétés par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ et divisés lorsqu’ils sont confluents à environ 70 %.
2. Observez les cellules tumorales adhérentes au microscope à fond clair ordinaire pour assurer une confluence de près de 70 %.
3. Prélever le milieu de culture du flacon à l’aide d’une pipette sérologie. Ajouter 3 mL de trypsine dans le flacon T75 et placer dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 3 à 5 min pour détacher les cellules du flacon.
4. Neutraliser la trypsine en utilisant une quantité égale (3 ml) de milieu de culture. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et faire tourner les cellules à 400 x g pendant 4 min pour les granuler.
5. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire.
6. Transférer 8 x 10⁵ cellules dans un autre tube de 15 ml et ajouter du PBS pour obtenir un volume de 1 ml.
7. Ajouter 2 μL d’ester de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFSE ; concentration mère de 5 μM) dans chaque tube et bien mélanger à l’aide d’une pipette de 1 mL.
8. Incuber les cellules avec CFSE pendant 20 min dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂. Retirez les tubes de l’incubateur après 20 minutes et ajoutez 5 mL de milieu de culture dans le tube.
9. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 4 min pour les agglutiner dans les cellules marquées CFSE. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 1 mL de milieu frais pour remettre les cellules en suspension.
10. Réévaluez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire. Transférer 4 x 10⁵ cellules dans un réservoir de réactif de 25 mL et ajouter le milieu pour un volume total de 8 mL.
    1. Pour assurer un volume suffisant pour ensemencer 5000 cellules tumorales / puits dans 100 μL de milieu, le volume devait pouvoir pipeter à l’aide de la pipette multicanal, et pour compenser la perte de quelques cellules au cours de l’étape 1.7, préparer 10% à 20% de cellules supplémentaires et un volume de milieu.
11. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. À l’aide d’une pipette multicanaux de 100 μL, pipeter 100 μL de la suspension cellulaire dans chaque rangée de la plaque noire transparente à fond plat à 96 puits sur la moitié gauche. Un exemple de stratégie de placage se trouve dans le tableau 2.
12. Pipeter les cellules EGFR KO de la même manière sur la moitié droite de la plaque. Une fois que toute la plaque est plaquée, faites glisser la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre sur la plate-forme de la hotte de culture tissulaire pour assurer une distribution uniforme des cellules tumorales dans les puits.
13. Incuber la plaque pendant 4 h dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pour que les cellules tumorales se fixent.

3. Co-culture de CAR exprimant des Jurkats avec des cellules tumorales marquées CFSE

1. À l’aide du nombre de cellules Jurkat non transduites et exprimant le CAR, transférez 4 x 10⁵ cellules de chaque CAR-J dans un réservoir de 25 ml. Ajouter le milieu de culture DMEM pour un volume total de 2 mL.
2. Pour un E :T de 4 :1, 2 x 10⁴ CAR-J ont été ajoutés par puits dans 100 μL de milieu à l’aide d’une pipette multicanal le long du côté de chaque puits afin de ne pas perturber les cellules tumorales attachées.
3. Ajouter 100 μL supplémentaires de milieu de croissance à l’aide d’une pipette multicanal sur le côté des puits contenant des cellules tumorales et des cellules de Jurkat. Les groupes de tumeurs seulement reçoivent 200 μL de milieu, ce qui fait un total de 300 μL de milieux dans tous les puits.
4. Faites glisser la plaque le long de la plate-forme d’avant en arrière et d’un mouvement latéral pour assurer une distribution uniforme des cellules Jurkat sur les cellules tumorales.
5. Permettre la co-culture dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 48 h.

4. Préparation de la plaque pour l’imagerie

1. Préparer une solution d’iodure de propidium (IP) à 1 μg/mL dans un milieu à faible fluorescence de fond en fonction du nombre de puits et de 100 μL de milieu chacun.
2. Pour 84 puits, préparez 9 mL de milieu contenant de l’IP. Mélangez bien le milieu à l’aide d’une pipette.
3. Préparez 10 mL de solution Triton-X à 20 % en diluant Triton-X avec de l’eau déminéralisée. Après 48 h de coculture, jeter le surnageant contenant le CAR-J par une seule inversion de la plaque et en tapotant sur du papier absorbant.
4. Ajoutez maintenant 100 μL de milieux préparés ci-dessus (étape 4.2) contenant de l’IP dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal doucement afin de ne pas perturber les cellules tumorales adhérentes.
5. Ajouter 20 μL de solution Triton-X à 20 % dans le premier puits de chaque type de tumeur, ce qui fonctionne comme un contrôle total mort.
6. Laissez l’assiette dans l’incubateur pendant 20 min. Imagez la plaque à l’aide du cytomètre d’imagerie à fluorescence. Les données sont stockées sur l’ordinateur et peuvent être analysées ultérieurement.

5. Analyse d’images fluorescentes

1. Utilisez l’un des seuls puits de cellules tumorales pour définir le canal fluorescent vert.
2. Diminuez le masque du puits à 98% pour supprimer les cellules sur le bord du puits car le signal n’est pas parfait sur le bord.
3. Identifier les cellules tumorales marquées CFSE sur le canal CFSE vert et fluorescent. Modifiez la valeur seuil de l’intensité de fluorescence pour récupérer toutes les cellules du puits.
4. Réglez le diamètre minimal de la cellule sur 25 μm pour éliminer tous les débris détectés sur le canal CFSE. Cela varie en fonction du type de cellule analysé.
5. Activez l’option Objets tactiles séparés pour identifier les cellules individuelles lorsqu’elles sont en contact les unes avec les autres.
6. Sélectionnez CFSE sur l’affichage de l’image et examinez la superposition graphique pour déterminer ce qui est sélectionné par le système.
7. Une fois que les cellules marquées CFSE sont correctement ramassées, définissez des portes pour définir la population de cellules vivantes par rapport à la population de cellules mortes.
8. En sélectionnant les cellules marquées CFSE, générez un histogramme des comptages sur l’axe des ordonnées en fonction de l’intensité IP moyenne sur l’axe des abscisses.
9. Sur la base du puits où nous avons ajouté Triton-X (étape 4.5), dessinez un séparateur pour différencier les cellules à faible PI colorées de celles à PI élevé. Ce puits devrait avoir la plupart des cellules dans une région fortement colorée par l’IP.
   REMARQUE : PI montre le signal basal sur les cellules vivantes. Par conséquent, l’ajout de Triton-X tue toutes les cellules et elles se colorent vivement dans le canal fluorescent rouge. Cela facilite le dessin de portes pour séparer les cellules mortes des cellules vivantes.
10. Ajustez la valeur de l’axe des x pour mieux visualiser les cellules. Étiquetez maintenant les cellules faiblement colorées par l’IP comme des cellules vivantes.
11. En sélectionnant les cellules dynamiques, définissez un autre histogramme avec une aire sur l’axe des x et des comptes sur l’axe des y.
12. Dessinez un autre séparateur en utilisant uniquement la tumeur pour capturer les cellules et non les débris. Les puits traités par Jurkat commenceront à accumuler des débris qui seront tachés par le CFSE et devront être retirés des comptes. Les autres non-débris sont étiquetés comme « Grosses cellules ».
13. Exécutez l’analyse sur l’ensemble de la plaque et exportez la feuille de calcul contenant les chiffres.
14. Tracez les grands nombres pour identifier le nombre de cellules tumorales vivantes marquées au CFSE restant dans le puits après l’exposition au CAR-J. Déterminer les statistiques à l’aide de l’ANOVA à un facteur.

Résultats

Une plage de rapport E :T comprise entre 1 :8 et 8 :1 pour CAR-J1 a été évaluée à 72 h et ciblait l’EGFR sur les cellules TNBC MDA-MB-231. Les cellules Jurkat ont été transduites avec le lentivirus CAR avec du polybrène pour générer des cellules CAR-J comme décrit à l’étape 2. La cytotoxicité du CAR-J1 augmentait significativement avec un rapport E :T plus élevé, sans différence dans la destruction à un rapport de 1 :8 (Figure 1). Plus de 50 % des abattages ont ét...

Discussion

Nous avons proposé ici une méthode rapide pour évaluer efficacement l’activité cytolytique spécifique à la cible induite par l’expression de CAR dans les cellules de Jurkat. Toutes les constructions CAR ont le même scFv mais des domaines de charnière et de transmembrane différents dont il a été démontré qu’ils affectent la puissance des cellules CAR-T¹³. Une évaluation plus poussée de la destruction non spécifique par ces CAR-J a été effectuée en les cultivant avec des cel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work