Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente

Résumé

Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.

Résumé

Les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont à l’avant-garde de l’oncologie. Un CAR est constitué d’un domaine de ciblage (généralement un fragment variable à chaîne unique, scFv), accompagné d’un linker intra-chaîne, suivi d’une charnière, d’une membrane et d’un domaine costimulateur. La modification du domaine de liaison intra-chaîne et de charnière peut avoir un effet significatif sur la destruction médiée par le CAR. Compte tenu des nombreuses options différentes pour chaque partie d’une construction CAR, il existe un grand nombre de permutations. La fabrication de cellules CAR-T est un processus long et coûteux, et la fabrication et le test de nombreuses constructions représentent un investissement important en temps et en matériel. Ce protocole décrit une plate-forme permettant d’évaluer rapidement les constructions CAR optimisées pour les charnières dans les cellules Jurkat (CAR-J). Les cellules Jurkat sont une lignée de lymphocytes T immortalisée avec une absorption élevée des lentivirus, permettant une transduction efficace du CAR. Nous présentons ici une plate-forme permettant d’évaluer rapidement CAR-J à l’aide d’un imageur fluorescent, suivie d’une confirmation de la cytolyse dans les lymphocytes T dérivés de PBMC.

Introduction

La thérapie cellulaire CAR-T s’est révélée très prometteuse dans les hémopathies malignes, comme en témoignent les 6 produits CAR-T approuvés par la FDA depuis 2017, comme l’a rapporté le National Cancer Institute¹. Il existe de nombreuses cellules CAR-T dans les essais cliniques pour cibler les tumeurs solides. L’ingénierie de nouvelles cibles CAR et l’optimisation de la construction CAR sont essentielles à l’efficacité d’une cellule CAR-T. Le choix de la construction CAR idéale pour chaque application est essentiel pour cibler avec précision les antigènes associés à la tumeur (TAA) tout en évitant de faibles niveaux d’expression de TAA dans l....

Protocole

REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire sont effectués dans une enceinte de sécurité biologique avec une blouse de laboratoire, des gants et en suivant les techniques aseptiques standard.

1. Génération de Jurkats exprimant le CAR (CAR-J)

1. Achetez des cellules Jurkat, clonez E6-1 auprès d’ATCC. Décongeler 1 x 10⁶ cellules dans une fiole T-75 et les cultiver dans des fioles T-75. Maintenez-les en suspension à raison de 0,6 x 10⁶ cellules par ml à l’aide d’un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de FBS dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.<....

Discussion

Nous avons proposé ici une méthode rapide pour évaluer efficacement l’activité cytolytique spécifique à la cible induite par l’expression de CAR dans les cellules de Jurkat. Toutes les constructions CAR ont le même scFv mais des domaines de charnière et de transmembrane différents dont il a été démontré qu’ils affectent la puissance des cellules CAR-T¹³. Une évaluation plus poussée de la destruction non spécifique par ces CAR-J a été effectuée en les cultivant avec des cel.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work