Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri onkolojinin ön saflarında yer alır. Bir CAR, eşlik eden bir zincir içi bağlayıcı ve ardından bir menteşe, transmembran ve yardımcı uyarıcı alan ile bir hedefleme alanından (genellikle tek zincirli değişken bir parça, scFv) oluşur. Zincir içi bağlayıcı ve menteşe alanının değiştirilmesi, CAR aracılı öldürme üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bir CAR yapısının her bir parçası için birçok farklı seçenek göz önüne alındığında, çok sayıda permütasyon vardır. CAR-T hücreleri yapmak zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir ve birçok yapıyı yapmak ve test etmek ağır bir zaman ve malzeme yatırımıdır. Bu protokol, Jurkat hücrelerinde (CAR-J) menteşe için optimize edilmiş CAR yapılarını hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platformu açıklar. Jurkat hücreleri, verimli CAR transdüksiyonuna izin veren, yüksek lentivirüs alımına sahip ölümsüzleştirilmiş bir T hücre hattıdır. Burada, bir floresan görüntüleyici kullanarak CAR-J'yi hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platform sunuyoruz, ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde sitolizin doğrulanması geliyor.

Giriş

CAR-T hücre tedavisi, Ulusal Kanser Enstitüsü6 tarafından bildirildiği üzere, 2017'den bu yana 1 FDA onaylı CAR-T ürününden de anlaşılacağı gibi, hematolojik malignitelerde büyük umut vaat etmektedir. Katı tümörleri hedeflemek için klinik çalışmalarda çok sayıda CAR-T hücresi vardır. Yeni CAR hedeflerinin mühendisliği ve CAR yapısının optimize edilmesi, bir CAR-T hücresinin etkinliği için hayati önem taşır. Her uygulama için ideal CAR yapısının seçilmesi, normal dokularda düşük TAA ekspresyon seviyelerinden kaçınırken, tümörle ilişkili antijenlerin (TAA) doğru hedeflenmesi için gereklidir2.

Bir CAR yapısı temel olarak beş bölmeden oluşur: (1) tümör antijenini hedefleyen hücre dışı tek zincirli değişken fragman (scFv) alanı; (2) menteşe alanı; (3) transmembran alanı; (4) hücre içi sitoplazmik T hücresi uyarıcı alanı; ve (5) sinyal alanı. Bu alanların her birinin değiştirilmesi, hedef hücresi3 ile etkileşime giren CAR-T hücresinin hassasiyetini etkiler. Bu nedenle, bu CAR yapılarının sitotoksisitesini ve çapraz reaktivitesini in vitro olarak değerlendirmek, in vivo deneylere doğru ilerlemek için doğru yapıyı seçmek için kritik öneme sahiptir. T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin mevcut yöntemleri arasında 51Cr salım testi, laktat dehidrojenaz salım testi, biyolüminesan görüntüleme testi, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analizi ve hücre bazlı akış sitometrisi testi 4,5 bulunur. Burada açıklanan floresan görüntüleme tabanlı platform, T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin dolaylı bir yönteminin aksine, T hücresi sitolizinin doğrudan bir miktar tayini olan canlı ve ölü hücrelerin sayısını tanımlar.

İşte MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerine karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sitotoksisitesini değerlendirmek için minimum müdahale ile kolay, uygun maliyetli, hızlı ve yüksek verimli bir tekniktir ve EGFR CRISPR MDA-MB-231 hücrelerini devre dışı bırakır. Jurkat hücreleri, T hücresi aktivasyonunu ve sinyal mekanizmalarını incelemek için yaygın olarak kullanılanölümsüzleştirilmiş insan T Lenfosit Hücreleri6'dır 7. Ayrıca, Jurkat hücreleri, çoklu çalışmalarda in vitro CAR testi için kullanılmıştır 8,9,10,11. Jurkat hücreleri, lentivirüs tarafından kolayca transdüksiyona sahiptir ve sürekli proliferasyona sahiptir ve bu sistem, çeşitli EGFR CAR yapılarının menteşe alanını optimize etmek için kullanılmıştır.

Bu test, çeşitli tümör antijenlerini hedef alan çoklu CAR yapılarını taramak için kullanılabilir ve çoklu yapışık tümör hücre hatlarına karşı ve çeşitli efektör/tümör (E:T) oranlarında kullanılabilir. Ek olarak, birden fazla zaman noktası değerlendirilebilir ve çeşitli CAR yapıları arasında en iyi öldürmeyi belirlemek için kopya sayısı değiştirilebilir. En iyi yapıların, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen CD3 T hücreleri kullanılarak doğrulanması gerekir. Bu yöntemin geliştirilmesinin arkasındaki genel amaç, düşük iletim verimliliği gibi engellerin üstesinden gelerek CAR menteşe geometrisini yüksek verimli bir şekilde hızla optimize etmek ve ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde onay almaktır.

Protokol

NOT: Tüm hücre kültürü çalışmaları, laboratuvar önlüğü, eldivenler ve standart aseptik teknikler izlenerek bir biyogüvenlik kabininde yapılır.

1. Jurkatları ifade eden CAR oluşturma (CAR-J)

  1. Jurkat hücrelerini satın alın, ATCC'den E6-1'i klonlayın. Bir T-75 şişesinde 1 x 106 hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde% 10 FBS ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamını kullanarak mL başına 0.6 x10 6 hücrede süspansiyon halindetutun.
  2. Plaka 1 x 10 5 Jurkat hücresi ile muamele edilmiş bir doku kültürünün oyuğu başına24 oyuklu plaka, lentiviral verimliliği artıran 4 μg / mL polibren içeren 500 μL RPMI büyüme ortamında plaka. Lazer tabanlı bir floresan algılama tezgah üstü hücre analizörü kullanarak hücreleri sayın. Kuyu sayısı, değerlendirilecek yapı sayısına bağlıdır. Bu örnekte 4 yapı ve dönüştürülmemiş bir denetim kullanılacaktır. CAR yapı tasarımı Tablo 1'de gösterilmektedir.
  3. Her CAR yapısından 10 μL lentivirüs / kuyu ekleyin. CAR yapı tasarımı ve lentivirüs üretimi daha önceanlatıldığı gibi yapıldı 12.
  4. Ertesi gün, her bir kuyucuğa 1 mL büyüme RPMI ortamı ekleyin ve inkübatörde 37 °C'de% 5 CO2 ile kültürlemeye devam edin.
  5. Hücreleri 2 gün sonra toplayın (Jurkat transdüksiyonundan toplam 72 saat sonra) ve sayın.
  6. Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonunu doğrulamak için çalışan akış için 1 x 104 hücre alın. Kısaca, CAR-J'yi 4 °C'de karanlıkta 30 dakika boyunca CAR pozitifliğini tespit etmek için kullanılan Bayrak etiketini hedefleyen antikorlarla etiketlemeden önce hücreleri 2x FACS boyama solüsyonu (FSS) ile yıkayın. FSS ile tekrar 2 kez yıkayın ve hücreleri daha önce tarif edildiği gibi bir akış sitometresinden geçirin12. Üretici tarafından önerilen antikor konsantrasyonunu kullanın.
  7. Jurkat hücreleri kolayca transdüksiyona uğrar ve neredeyse her zaman %>90 CAR ekspresyonu gösterir. Ko-kültür sitotoksisite testinden çok önce CAR-J üretin ve daha sonra kullanmak üzere dondurun.

2. CFSE etiketli tümör hücrelerinin kaplanması

NOT: MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26'dan) hücreleri bir işbirlikçinin hediyesiydi ve EGFR KO MDA-MB-231 daha önce açıklandığı gibioluşturuldu 12.

  1. Bir T-75 şişesinde 1 x 106 hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. MDA-MB-231 tümör hücrelerini ve CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tümör hücrelerini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun modifiye kartal ortamının (DMEM) 14 mL'sinde 37 ° C'de bir inkübatörde% 5 CO2 ile koruyun ve yaklaşık% 70 birleştiğinde bölünür.
  2. Yaklaşık% 70 birleşmeyi sağlamak için düzenli parlak alan mikroskobu altında yapışık tümör hücrelerini gözlemleyin.
  3. Serolojik bir pipet kullanarak büyüme ortamını şişeden çıkarın. T75 şişesine 3 mL tripsin ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için 3-5 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre koyun.
  4. Eşit miktarda (3 mL) büyüme ortamı kullanarak tripsini nötralize edin. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve hücreleri peletlemek için 4 dakika boyunca hücreleri 400 x g'da döndürün.
  5. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
  6. 8 x 105 hücreyi başka bir 15 mL'lik tüpe aktarın ve 1 mL'lik bir hacme ulaşmak için PBS ekleyin.
  7. Her tüpe 2 μL karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE; 5 μM stok konsantrasyonu) ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
  8. Hücreleri CFSE ile inkübatörde 20 dakika boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Tüpleri 20 dakika sonra inkübatörden çıkarın ve tüpe 5 mL büyüme ortamı ekleyin.
  9. CFSE etiketli hücreleri peletlemek için tüpleri 400 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL taze ortam ekleyin.
  10. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu yeniden değerlendirin. 4 x 105 hücreyi 25 mL'lik bir reaktif rezervuarına aktarın ve toplam 8 mL'lik bir hacim için ortam ekleyin.
    1. 100 μL ortamda 5000 tümör hücresini/kuyusunu tohumlamak için yeterli hacmi sağlamak için, çok kanallı pipeti kullanarak pipetleme yapabilmek ve adım 1.7 sırasında birkaç hücre kaybını telafi etmek için hacim gerekiyordu, %10-20 ekstra hücre ve ortam hacmi hazırlayın.
  11. Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın. 100 μL'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, sol yarıdaki şeffaf düz tabanlı siyah 96 oyuklu plakanın her sırasına 100 μL hücre süspansiyonu pipetleyin. Örnek bir kaplama stratejisi Tablo 2'de bulunabilir.
  12. EGFR KO hücrelerini benzer şekilde plakanın sağ yarısına pipetleyin. Tüm plaka kaplandıktan sonra, tümör hücrelerinin oyuklarda eşit dağılımını sağlamak için plakayı doku kültürü başlığı platformunda ileri geri ve yan yana sürükleyin.
  13. Tümör hücrelerinin tutunması için plakayı inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile 4 saat inkübe edin.

3. Jurkatları CFSE etiketli tümör hücreleri ile eksprese eden CAR'ın birlikte kültürlenmesi

  1. Transdüksiyonsuz ve CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sayımlarını kullanarak, her bir CAR-J'nin 4 x 105 hücresini 25 mL'lik bir rezervuara aktarın. Toplam 2 mL hacim için DMEM büyüme ortamı ekleyin.
  2. 4:1 E:T için, bağlı tümör hücrelerini rahatsız etmemek için her bir oyuğun kenarı boyunca nazikçe çok kanallı bir pipet kullanılarak 100 μL ortamda oyuk başına 2 x 104 CAR-J ilave edildi.
  3. Tümör hücreleri ve Jurkat hücreleri içeren kuyucukların kenarına çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL daha büyüme ortamı ekleyin. Sadece tümör grupları, tüm oyuklarda toplam 300 μL ortam yapmak için 200 μL ortam alır.
  4. Jurkat hücrelerinin tümör hücreleri üzerinde eşit dağılımını sağlamak için plakayı platform boyunca ileri geri ve yan yana hareketlerle sürükleyin.
  5. İnkübatörde 37 °C'de 48 saat boyunca% 5 CO2 ile kokültüre izin verin.

4. Görüntüleme için plakanın hazırlanması

  1. Kuyucuk sayısına bağlı olarak düşük arka plan floresan ortamında 1 μg/mL'de bir propidyum iyodür (PI) çözeltisi yapın ve her biri 100 μL ortam elde edin.
  2. 84 kuyu için PI içeren 9 mL ortam hazırlayın. Ortamı bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
  3. Triton-X'i deiyonize su ile seyrelterek 10 mL %20 Triton-X çözeltisi yapın. 48 saatlik kokültürden sonra, CAR-J içeren süpernatanı, plakanın tek bir ters çevrilmesiyle ve kağıt havluya hafifçe vurarak atın.
  4. Şimdi, yapışan tümör hücrelerini rahatsız etmemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa PI içeren 100 μL yukarıda hazırlanmış ortam (adım 4.2) ekleyin.
  5. Her tümör tipinin ilk kuyucuğuna 20 μL% 20 Triton-X çözeltisi ekleyin, bu da toplam ölü kontrol işlevi görür.
  6. Plakayı inkübatörde 20 dakika bekletin. Floresan görüntüleme sitometresini kullanarak plakayı görüntüleyin. Veriler bilgisayarda saklanır ve daha sonra analiz edilebilir.

5. Floresan görüntülerin analizi

  1. Yeşil floresan kanalını ayarlamak için tümör hücrelerinden birini kullanın.
  2. Kuyu kenarındaki hücreleri çıkarmak için kuyu maskesini %98'e düşürün, çünkü sinyal kenarda mükemmel değildir.
  3. Yeşil, floresan CFSE kanalındaki CFSE etiketli tümör hücrelerini tanımlayın. Kuyudaki tüm hücreleri almak için floresan yoğunluğu eşik değerini değiştirin.
  4. CFSE kanalında tespit edilen kalıntıları temizlemek için minimum hücre çapını 25 μm'ye ayarlayın. Bu, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişir.
  5. Birbirleriyle temas halinde olduklarında tek tek hücreleri tanımlamak için Ayrı Dokunma Nesneleri'ni etkinleştirin.
  6. Görüntü ekranında CFSE'yi seçin ve sistem tarafından neyin seçildiğini anlamak için grafik kaplamaya bakın.
  7. CFSE etiketli hücreler düzgün bir şekilde alındıktan sonra, canlı ve ölü hücre popülasyonunu tanımlamak için kapılar ayarlayın.
  8. CFSE etiketli hücreleri seçerek, y ekseninde ve x ekseninde ortalama PI yoğunluğuna karşı bir sayım histogramı oluşturun.
  9. Triton-X'i eklediğimiz kuyuya dayanarak (adım 4.5), düşük PI lekeli ve yüksek PI lekeli hücreleri ayırt etmek için bir ayırıcı çizin. Bu kuyu, yüksek PI lekeli bir bölgede hücrelerin çoğuna sahip olmalıdır.
    NOT: PI, canlı hücrelerde bazal sinyal gösterir. Bu nedenle, Triton-X eklemek tüm hücreleri öldürür ve kırmızı floresan kanalında parlak bir şekilde boyanırlar. Bu, ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırmak için kapıların çizilmesini kolaylaştırır.
  10. Hücreleri daha iyi görüntüleyebilmek için x ekseni değerini ayarlayın. Şimdi düşük PI lekeli hücreleri Canlı hücreler olarak etiketleyin.
  11. Canlı hücreleri seçerek, x ekseninde alan ve y ekseninde sayılan başka bir histogram ayarlayın.
  12. Enkazı değil, hücreleri yakalamak için tümörü iyi kullanarak başka bir ayırıcı çizin. Jurkat ile muamele edilmiş kuyular, CFSE lekelenecek ve sayımlardan çıkarılması gereken enkaz biriktirmeye başlayacaktır. Kalan enkaz olmayanlar "Büyük hücreler" olarak etiketlenir.
  13. Analizi tüm plaka üzerinde çalıştırın ve sayıları içeren elektronik tabloyu dışa aktarın.
  14. CAR-J'ye maruz kaldıktan sonra kuyuda kalan canlı CFSE etiketli tümör hücrelerinin sayısını belirlemek için Büyük sayıları çizin. Tek yönlü ANOVA kullanarak istatistikleri belirleyin.

Sonuçlar

CAR-J1 için 1: 8 ile 8: 1 arasında bir E: T oranı aralığı, TNBC MDA-MB-231 hücrelerinde EGFR'yi hedefleyen 72 saatte değerlendirildi. Jurkat hücreleri, adım 2'de tarif edildiği gibi CAR-J hücreleri oluşturmak için polibren ile CAR lentivirüsü ile transdüksiyona tabi tutuldu. CAR-J1'in sitotoksisitesi, 1: 8 oranında öldürmede hiçbir fark olmaksızın daha yüksek E: T oranı ile önemli ölçüde artmıştır (Şekil 1). 72 saat boyunca 4:1 E:T'de %50'den fazla öldürme ...

Tartışmalar

Burada, Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonu tarafından indüklenen hedefe özgü sitolitik aktiviteyi verimli bir şekilde değerlendirmek için hızlı bir yöntem önerdik. Tüm CAR yapıları aynı scFv'ye sahiptir, ancak CAR-T hücrelerinin potensini etkilediği gösterilen farklı menteşe ve transmembran alanları13. Bu CAR-J tarafından spesifik olmayan öldürmenin daha ileri değerlendirmesi, antijen nakavt (KO) hücreleri ile kültürlenerek yapıldı. Bu, öldürmenin tümör antijeni...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

MDA-MB-231, Dr. Shane Stecklein'ın nazik bir hediyesiydi. Yazarlar, bu araştırmayı yürütmek için Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi'nden fon aldığını kabul ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Tube (Sterile)Midwest Scientific#C15BAny similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)Thermo Scientific339652Any similar will work
Black/Clear 96 well plateFalcon353219Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CAny similar will work
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersion 5.3.0.0Any similar will work
Cell Culture IncubatorThermo ScientificHeraCell 160iAny similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)TPP90076Any similar will work
CFSETonbo13-0850-U500Any similar will work
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Any similar will work
DMEMGibco11995-040Any similar will work
FBSGemini bio-products900-108Any similar will work
Flow CytometerCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcAny similar will work
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Company Version 10.7.1Any similar will work
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Any similar will work
GraphPad SoftwareGraphPadVersion 9.3.1 (471)Any similar will work
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
PBSGibco10010-031Any similar will work
PenStrepGibco15070-063Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)Pr1maPR-1250RK-FL, etcAny similar will work
Pipettors Thermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
Propidium IodideInvitrogenP1304MPAny similar will work
RPMICorning10-041-cvAny similar will work
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)Pr1maPR-SERO-25, etcAny similar will work
Sodium PyruvateCorning25-000-CIAny similar will work
Sterile ReservoirsMidwest ScientificRESE-2000Any similar will work
Table top centrifugeEppendorf5810RAny similar will work

Referanslar

  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
  4. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
  5. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  6. Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
  7. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
  8. Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
  9. Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
  10. Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
  11. Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
  12. Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
  13. Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
  14. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  15. Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
  16. Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
  17. Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
  18. Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
  19. Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
  20. . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
  21. Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H zlIn VitroSitotoksisite De erlendirmesiJurkatKimerik Antijen Resept rFloresan G r nt lemeCAR T H creleriHedefleme AlanTek Zincirli De i ken FragmanZincir i Ba lay cMente e AlanTransmembran AlanKostim lat r AlanCAR Yap sCAR Arac l ld rmeCAR T H creleriZaman Al c S rePahal S reTest Yap larZaman ve Malzeme Yat r mPlatformMente e in Optimize Edilmi CAR Yap larJurkat H creleriLentivir s Al mCAR Transd ksiyonuFloresan G r nt leyiciSitolizPBMC kaynakl T H creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır