Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi

Özet

Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri onkolojinin ön saflarında yer alır. Bir CAR, eşlik eden bir zincir içi bağlayıcı ve ardından bir menteşe, transmembran ve yardımcı uyarıcı alan ile bir hedefleme alanından (genellikle tek zincirli değişken bir parça, scFv) oluşur. Zincir içi bağlayıcı ve menteşe alanının değiştirilmesi, CAR aracılı öldürme üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bir CAR yapısının her bir parçası için birçok farklı seçenek göz önüne alındığında, çok sayıda permütasyon vardır. CAR-T hücreleri yapmak zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir ve birçok yapıyı yapmak ve test etmek ağır bir zaman ve malzeme yatırımıdır. Bu protokol, Jurkat hücrelerinde (CAR-J) menteşe için optimize edilmiş CAR yapılarını hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platformu açıklar. Jurkat hücreleri, verimli CAR transdüksiyonuna izin veren, yüksek lentivirüs alımına sahip ölümsüzleştirilmiş bir T hücre hattıdır. Burada, bir floresan görüntüleyici kullanarak CAR-J'yi hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platform sunuyoruz, ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde sitolizin doğrulanması geliyor.

Giriş

CAR-T hücre tedavisi, Ulusal Kanser Enstitüsü⁶ tarafından bildirildiği üzere, 2017'den bu yana 1 FDA onaylı CAR-T ürününden de anlaşılacağı gibi, hematolojik malignitelerde büyük umut vaat etmektedir. Katı tümörleri hedeflemek için klinik çalışmalarda çok sayıda CAR-T hücresi vardır. Yeni CAR hedeflerinin mühendisliği ve CAR yapısının optimize edilmesi, bir CAR-T hücresinin etkinliği için hayati önem taşır. Her uygulama için ideal CAR yapısının seçilmesi, normal dokularda düşük TAA ekspresyon seviyelerinden kaçınırken, tümörle ilişkili antijenlerin (TAA) doğru hedeflenmesi için gereklidir².

Bi....

Protokol

NOT: Tüm hücre kültürü çalışmaları, laboratuvar önlüğü, eldivenler ve standart aseptik teknikler izlenerek bir biyogüvenlik kabininde yapılır.

1. Jurkatları ifade eden CAR oluşturma (CAR-J)

1. Jurkat hücrelerini satın alın, ATCC'den E6-1'i klonlayın. Bir T-75 şişesinde 1 x 10⁶ hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde% 10 FBS ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamını kullanarak mL başına 0.6 x^{10 6} hücrede süspansiyon halinde_tutun.
2. Plaka 1 x 10 5 Jurkat hücresi ile muamele edilmiş bir doku kültürünün o....

Tartışmalar

Burada, Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonu tarafından indüklenen hedefe özgü sitolitik aktiviteyi verimli bir şekilde değerlendirmek için hızlı bir yöntem önerdik. Tüm CAR yapıları aynı scFv'ye sahiptir, ancak CAR-T hücrelerinin potensini etkilediği gösterilen farklı menteşe ve transmembran alanları¹³. Bu CAR-J tarafından spesifik olmayan öldürmenin daha ileri değerlendirmesi, antijen nakavt (KO) hücreleri ile kültürlenerek yapıldı. Bu, öldürmenin tümör antijeni.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work