Evaluación rápida de la citotoxicidad in vitro del receptor de antígeno quimérico que expresa jurkat mediante imágenes fluorescentes

Resumen

Un protocolo para evaluar la destrucción cuantitativa de células tumorales por células Jurkat que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un solo antígeno tumoral. Este protocolo se puede utilizar como plataforma de cribado para la optimización rápida de las construcciones de bisagras de CAR antes de la confirmación en células T derivadas de sangre periférica.

Resumen

Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) están a la vanguardia de la oncología. Un CAR se construye a partir de un dominio diana (generalmente un fragmento variable de cadena única, scFv), con un enlazador intracadena que lo acompaña, seguido de un dominio bisagra, transmembrana y coestimulador. La modificación del enlazador intracadena y del dominio de bisagra puede tener un efecto significativo en la muerte mediada por CAR. Teniendo en cuenta las muchas opciones diferentes para cada parte de una construcción CAR, hay un gran número de permutaciones. La fabricación de células CAR-T es un proceso largo y costoso, y la fabricación y prueba de muchas construcciones requiere una gran inversión de tiempo y material. Este protocolo describe una plataforma para evaluar rápidamente las construcciones de CAR optimizadas para bisagras en células Jurkat (CAR-J). Las células Jurkat son una línea de células T inmortalizadas con una alta absorción de lentivirus, lo que permite una transducción eficiente de CAR. Aquí, presentamos una plataforma para evaluar rápidamente CAR-J utilizando un generador de imágenes fluorescente, seguido de la confirmación de la citólisis en células T derivadas de PBMC.

Introducción

La terapia de células CAR-T ha demostrado ser muy prometedora en neoplasias malignas hematológicas, lo que se evidencia en los 6 productos CAR-T aprobados por la FDA desde 2017, según lo informado por el Instituto Nacional del Cáncer¹. Existen numerosas células CAR-T en ensayos clínicos para atacar tumores sólidos. La ingeniería de nuevos objetivos CAR y la optimización de la construcción de CAR son vitales para la eficacia de una célula CAR-T. La elección de la construcción de CAR ideal para cada aplicación es esencial para una orientación precisa de los antígenos asociados al tumor (TAA) y, al mismo tiempo, evitar niveles bajos de expresión de TAA en los tejidos normales².

Una construcción de CAR se compone principalmente de cinco compartimentos: (1) dominio extracelular de fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido al antígeno tumoral; (2) dominio de bisagra; (3) dominio transmembrana; (4) dominio coestimulador intracelular de células T citoplasmáticas; y (5) dominio de señalización. La modificación de cada uno de estos dominios afecta a la precisión de la célula CAR-T que interactúa con su célula diana³. Por lo tanto, la evaluación de la citotoxicidad y la reactividad cruzada de estas construcciones de CAR in vitro es fundamental para elegir la construcción correcta para avanzar hacia experimentos in vivo. Los métodos actuales para evaluar la citólisis por células T incluyen el ensayo de liberación de ⁵¹Cr, el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa, el ensayo de imágenes bioluminiscentes, el análisis celular basado en impedancia en tiempo real y el ensayo de citometría de flujo basado en células ^4,5. La plataforma basada en imágenes fluorescentes descrita aquí identifica el número de células vivas frente a las muertas, que es una cuantificación directa de la citólisis de células T en lugar de un método indirecto de evaluación de la citólisis por parte de las células T.

Esta es una técnica fácil, rentable, rápida y de alto rendimiento con una intervención mínima para evaluar la citotoxicidad de las células Jurkat que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) CAR contra las células de cáncer de mama triple negativo (TNBC) MDA-MB-231 y las células EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231. Las células Jurkat son células de linfocitos T humanos inmortalizadas⁶ que se han utilizado ampliamente para estudiar la activación de las células T y los mecanismos de señalización⁷. Además, las células Jurkat se han utilizado para pruebas in vitro de CAR en múltiples estudios ^8,9,10,11. Las células Jurkat son fácilmente transducidas por lentivirus y tienen una proliferación sostenida, y este sistema se aprovechó para optimizar el dominio de bisagra de varias construcciones de EGFR CAR.

Este ensayo se puede utilizar para el cribado de múltiples construcciones de CAR dirigidas a varios antígenos tumorales y se puede utilizar contra múltiples líneas celulares tumorales adherentes y en varias proporciones efectora-tumoral (E:T). Además, se pueden evaluar múltiples puntos de tiempo y se puede modificar el número de réplicas para identificar la mejor eliminación entre las diversas construcciones de CAR. Los mejores constructos deben confirmarse utilizando células T CD3 derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El objetivo general detrás del desarrollo de este método es optimizar rápidamente la geometría de la bisagra CAR de una manera de alto rendimiento, superando barreras como la baja eficiencia de transducción, seguida de la confirmación en células T derivadas de PBMC.

Protocolo

NOTA: Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en una cabina de bioseguridad con bata de laboratorio, guantes y siguiendo las técnicas asépticas estándar.

1. Generación de CAR que expresa Jurkats (CAR-J)

1. Compre células Jurkat, clon E6-1 de ATCC. Descongelar 1 x 10⁶ células en un matraz T-75 y cultivarlas en matraces T-75. Manténgalos en suspensión a 0,6 x 10⁶ células por ml utilizando medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementados con 10% de FBS en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Placa 1 x 10⁵ células Jurkat por pocillo de un cultivo de tejidos tratado Placa de 24 pocillos en 500 μL de medio de crecimiento RPMI que contiene 4 μg/mL de polibreno que mejora la eficiencia lentiviral. Cuente las células con un analizador de células de sobremesa de detección fluorescente basado en láser. El número de pozos depende del número de constructos a evaluar. En este ejemplo se utilizarán 4 construcciones y un control sin transducir. El diseño de la construcción del CAR se muestra en la Tabla 1.
3. Agregue 10 μL de lentivirus/pocillo de cada construcción de CAR. El diseño de la construcción de la CAR y la producción de lentivirus se realizó como se describió anteriormente¹².
4. Al día siguiente, agregue 1 mL de medio RPMI de crecimiento a cada pocillo y continúe cultivando en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
5. Recoja las células 2 días después (total 72 h después de la transducción de Jurkat) y cuéntelas.
6. Tome 1 x 10⁴ celdas para el flujo continuo para confirmar la expresión de CAR en las celdas Jurkat. Lavar brevemente las células 2 veces con solución de tinción FACS (FSS) antes de etiquetar el CAR-J con anticuerpos dirigidos a la etiqueta Flag utilizada para detectar la positividad de CAR durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C. Lavar 2 veces de nuevo con FSS y pasar las células a través de un citómetro de flujo como se describió anteriormente¹². Use la concentración de anticuerpos según lo recomendado por el fabricante.
7. Las células Jurkat se transducen fácilmente y casi siempre muestran una expresión de CAR del >90%. Producir CAR-J mucho antes del ensayo de citotoxicidad de cocultivo y congelar para su uso posterior.

2. Siembra de células tumorales marcadas con CFSE

NOTA: LAS CÉLULAS MDA-MB-231 (de ATCC, HTB-26) fueron un regalo de un colaborador, y las EGFR KO MDA-MB-231 se crearon como se describió anteriormente¹².

1. Descongelar 1 x 10⁶ células en un matraz T-75 y cultivarlas en matraces T-75. Mantener las células tumorales MDA-MB-231 y las células tumorales CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 en 14 ml del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ y dividido cuando aproximadamente el 70% confluye.
2. Observe las células tumorales adherentes bajo un microscopio de campo claro regular para garantizar una confluencia de casi el 70%.
3. Retire el medio de crecimiento del matraz con una pipeta serológica. Añadir 3 ml de tripsina al matraz T75 y colocarlo en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante 3-5 min para separar las células del matraz.
4. Neutralice la tripsina usando la misma cantidad (3 mL) de medio de crecimiento. Recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga y gire las celdas a 400 x g durante 4 minutos para granular las celdas.
5. Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Determine la concentración de células utilizando un contador de células.
6. Transfiera 8 x 10⁵ células a otro tubo de 15 ml y agregue PBS para obtener un volumen de 1 ml.
7. Añadir 2 μL de éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE; 5 μM de concentración de stock) en cada tubo y mezclar bien con una pipeta de 1 mL.
8. Incubar las células con CFSE durante 20 min en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂. Retire los tubos de la incubadora después de 20 minutos y agregue 5 ml de medio de crecimiento al tubo.
9. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 4 min para granular las células marcadas con CFSE. Deseche el sobrenadante con una pipeta y agregue 1 ml de medio fresco para resuspender las células.
10. Vuelva a evaluar la concentración de células utilizando un contador de células. Transfiera 4 x 10⁵ células a un depósito de reactivo de 25 ml y agregue medios para un volumen total de 8 ml.
    1. Para garantizar un volumen suficiente para sembrar 5000 células tumorales/pocillo en 100 μl de medio, el volumen necesario para poder pipetear con la pipeta multicanal y, para compensar la pérdida de unas pocas células durante el paso 1.7, prepare entre un 10 % y un 20 % de células adicionales y volumen de medios.
11. Mezclar bien la suspensión celular con una pipeta serológica de 5 ml. Con una pipeta multicanal de 100 μL, pipetee 100 μL de la suspensión celular en cada fila de la placa negra de 96 pocillos de fondo plano transparente en la mitad izquierda. En la Tabla 2 se puede encontrar un ejemplo de estrategia de siembra.
12. Pipetea las células EGFR KO de forma similar en la mitad derecha de la placa. Una vez que toda la placa esté plateada, arrastre la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado en la plataforma de la campana de cultivo de tejidos para garantizar una distribución uniforme de las células tumorales en los pocillos.
13. Incubar la placa durante 4 h en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ para que las células tumorales se adhieran.

3. Cocultivo de Jurkats que expresan CAR con células tumorales marcadas con CFSE

1. Utilizando los recuentos de células Jurkat no transducidas y que expresan CAR, transfiera 4 x 10⁵ células de cada CAR-J a un depósito de 25 ml. Agregue medios de crecimiento DMEM para un volumen total de 2 ml.
2. Para E:T de 4:1, se añadieron 2 x 10⁴ CAR-J por pocillo en 100 μL de medio utilizando una pipeta multicanal suavemente a lo largo del costado de cada pocillo para no alterar las células tumorales adheridas.
3. Agregue otros 100 μL de medio de crecimiento con una pipeta multicanal al lado de los pocillos que contienen células tumorales y células Jurkat. Los grupos de tumores solo reciben 200 μL de medio para un total de 300 μL de medio en todos los pocillos.
4. Arrastre la placa a lo largo de la plataforma con movimientos hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para garantizar una distribución uniforme de las células Jurkat en las células tumorales.
5. Permitir el cocultivo en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante 48 h.

4. Preparación de la placa para la obtención de imágenes

1. Prepare una solución de yoduro de propidio (PI) a 1 μg/mL en medios de baja fluorescencia de fondo en función del número de pocillos y cada uno obtenga 100 μL de medio.
2. Para 84 pocillos, prepare 9 mL de medio que contenga PI. Mezcle bien el medio con una pipeta.
3. Prepare 10 ml de solución de Triton-X al 20% diluyendo Triton-X con agua desionizada. Después de 48 h de cocultivo, deseche el sobrenadante que contiene CAR-J mediante una sola inversión de la placa y golpeando una toalla de papel.
4. A continuación, añada 100 μL de los medios preparados anteriormente (paso 4.2) que contengan IP en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal con cuidado para no alterar las células tumorales adheridas.
5. Agregue 20 μL de solución de Triton-X al 20% al primer pocillo de cada tipo de tumor, lo que funciona como un control muerto total.
6. Deje la placa en la incubadora durante 20 min. Tome imágenes de la placa con el citómetro de imágenes fluorescentes. Los datos se almacenan en la computadora y se pueden analizar en un momento posterior.

5. Análisis de imágenes fluorescentes

1. Use una de las células tumorales para establecer el canal fluorescente verde.
2. Disminuya la máscara del pocillo al 98% para eliminar las celdas en el borde del pozo, ya que la señal no es perfecta en el borde.
3. Identificar las células tumorales marcadas con CFSE en el canal verde fluorescente de CFSE. Modifique el valor del umbral de intensidad de fluorescencia para recoger todas las células del pocillo.
4. Establezca el diámetro mínimo de la celda en 25 μm para eliminar cualquier residuo detectado en el canal CFSE. Esto varía según el tipo de célula que se analice.
5. Habilite Separar objetos táctiles para identificar células individuales cuando están en contacto entre sí.
6. Seleccione CFSE en la pantalla de la imagen y observe la superposición gráfica para averiguar qué está eligiendo el sistema.
7. Una vez que las células marcadas con CFSE se recojan correctamente, establezca puertas para definir la población de células vivas frente a las muertas.
8. Seleccionando las celdas marcadas con CFSE, genere un histograma de recuentos en el eje Y frente a la intensidad media de PI en el eje X.
9. Basándonos en el pocillo en el que añadimos Triton-X (paso 4.5), dibuje un divisor para diferenciar las células con tinción de PI bajo y las de tinción con PI alto. Este pocillo debe tener la mayoría de las células en una región con alta tinción de PI.
   NOTA: PI muestra la señal basal en las células vivas. Por lo tanto, la adición de Triton-X mata todas las células y se tiñen de brillo en el canal fluorescente rojo. Esto facilita el dibujo de puertas para separar las células muertas de las células vivas.
10. Ajuste el valor del eje x para poder ver mejor las celdas. Ahora etiquete las células teñidas con PI bajo como células vivas.
11. Al seleccionar las celdas vivas, establezca otro histograma con el área en el eje x y los recuentos en el eje y.
12. Dibuje otro divisor usando el tumor solo bien para capturar células y no desechos. Los pozos tratados con Jurkat comenzarán a acumular escombros que se teñirán con CFSE y deberán eliminarse de los conteos. El resto de los que no son escombros se etiquetan como "células grandes".
13. Ejecute el análisis en toda la placa y exporte la hoja de cálculo que contiene los números.
14. Grafique los recuentos grandes para identificar el número de células tumorales vivas marcadas con CFSE que permanecen en el pocillo después de la exposición a CAR-J. Determine estadísticas mediante ANOVA de un factor.

Resultados

Se evaluó un rango de relación E:T entre 1:8 y 8:1 para CAR-J1 a las 72 h que se dirigió a EGFR en células TNBC MDA-MB-231. Las células Jurkat se transducieron con lentivirus CAR con polibreno para generar células CAR-J como se describe en el paso 2. La citotoxicidad de CAR-J1 aumentó significativamente con una mayor relación E:T sin diferencias en la relación de muerte a 1:8 (Figura 1). Se observó más del 50% de muertes a 4:1 E:T durante 72 h. Este E:T se utilizó para experiment...

Discusión

Aquí hemos propuesto un método rápido para evaluar eficientemente la actividad citolítica específica de la diana inducida por la expresión de CAR en células Jurkat. Todas las construcciones de CAR tienen el mismo scFv pero diferentes dominios bisagra y transmembrana que se ha demostrado que afectan a la potencia de las células CAR-T¹³. La evaluación adicional de la destrucción inespecífica por parte de estos CAR-J se realizó mediante el cultivo con células knock-out de antígenos (KO)...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work