使用荧光成像快速体外细胞毒性评估表达嵌合抗原受体的 Jurkat

摘要

一种评估靶向单个肿瘤抗原的表达嵌合抗原受体 （CAR） 的 Jurkat 细胞定量肿瘤细胞杀伤的方案。该方案可用作筛选平台，用于在外周血来源的T细胞中确认之前快速优化CAR铰链结构。

摘要

嵌合抗原受体 （CAR） T 细胞处于肿瘤学的最前沿。CAR 由靶向结构域（通常是单链可变片段 scFv）构建，伴随链内连接子，然后是铰链、跨膜和共刺激结构域。链内连接子和铰链结构域的修饰可以对CAR介导的杀伤产生显着影响。考虑到 CAR 结构的每个部分都有许多不同的选项，因此有大量的排列。制造CAR-T细胞是一个耗时且昂贵的过程，制造和测试许多构建体是一项大量的时间和材料投资。该协议描述了一个平台，用于快速评估 Jurkat 细胞 （CAR-J） 中铰链优化的 CAR 构建体。Jurkat 细胞是一种永生化的 T 细胞系，具有高慢病毒摄取量，可实现高效的 CAR 转导。在这里，我们提出了一个使用荧光成像仪快速评估 CAR-J 的平台，然后确认 PBMC 衍生的 T 细胞的细胞溶解。

引言

据美国国家癌症研究所¹ 报道，CAR-T 细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出巨大的前景，自 2017 年以来，FDA 批准了 6 种 CAR-T 产品。有许多CAR-T细胞在临床试验中用于靶向实体瘤。设计新的CAR靶点和优化CAR结构对于CAR-T细胞的功效至关重要。为每种应用选择理想的 CAR 构建体对于准确靶向肿瘤相关抗原 （TAA） 至关重要，同时避免正常组织中 TAA 表达水平低²。

CAR 构建体主要由五个区室组成：（1） 靶向肿瘤抗原的细胞外单链可变片段 （scFv） 结构域;（2）铰链域;（3）跨膜结构域;（4）细胞内细胞质T细胞共刺激结构域;（5）信令域。修改这些结构域中的每一个都会影响 CAR-T 细胞与其靶细胞^{结合的精度 3}。因此，评估这些CAR构建体的细胞毒性和交叉反应性对于选择正确的构建体进行体内实验至关重要。目前评估 T 细胞溶解的方法包括 ⁵¹Cr 释放试验、乳酸脱氢酶释放试验、生物发光成像试验、基于实时阻抗的细胞分析和基于细胞的流式细胞术试验 ^4,5。这里描述的基于荧光成像的平台可识别活细胞与死细胞的数量，这是对 T 细胞溶解的直接....

研究方案

注意：所有细胞培养工作均在生物安全柜中完成，并配有实验室外套、手套并遵循标准无菌技术。

1. 生成表达 CAR 的 Jurkats （CAR-J）

1. 购买 Jurkat 细胞，从 ATCC 克隆 E6-1。在 T-75 烧瓶中解冻 1 x 10⁶ 个细胞，并在 T-75 烧瓶中培养。使用补充有10%FBS的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基在37°C和5%CO₂的培养箱中，以0.6×10⁶个细胞/mL的悬浮液维持它们。
2. 培养板 1 x 10 5 个 Jurkat 细胞，每孔组织培养物处理 24 孔板，在含有 4 μg/mL 聚凝胺的 500 μL RPMI 生长培养基中，可提高慢病毒效率。使用基于激光的荧光检测台式细胞分析仪对细胞进行计数。孔的数量取决于要评估的结构数量。此示例将使用 4 个构造和一个未转导的控件。CAR结构设计如表1所示。
3. 每个CAR构建体中加入10μL慢病毒/孔。CAR构建体设计和慢病毒生产如前所述¹²。
4. 第二天，向每个孔中加入1mL生长RPMI培养基，并继续在37°C的培养箱中用5%CO₂培养。
<....

讨论

在这里，我们提出了一种快速方法来有效地评估 Jurkat 细胞中 CAR 表达诱导的靶标特异性细胞溶解活性。所有 CAR 构建体具有相同的 scFv，但不同的铰链和跨膜结构域，这些结构域已被证明会影响 CAR-T 细胞的效力¹³。通过用抗原敲除 （KO） 细胞培养这些 CAR-J 来进一步评估这些 CAR-J 的非特异性杀伤。这表明杀伤是肿瘤抗原特异性的，而不是由于 CAR-J 的基础激活。可以很容易地确定?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work