使用荧光成像快速体外细胞毒性评估表达嵌合抗原受体的 Jurkat

摘要

一种评估靶向单个肿瘤抗原的表达嵌合抗原受体 （CAR） 的 Jurkat 细胞定量肿瘤细胞杀伤的方案。该方案可用作筛选平台，用于在外周血来源的T细胞中确认之前快速优化CAR铰链结构。

摘要

嵌合抗原受体 （CAR） T 细胞处于肿瘤学的最前沿。CAR 由靶向结构域（通常是单链可变片段 scFv）构建，伴随链内连接子，然后是铰链、跨膜和共刺激结构域。链内连接子和铰链结构域的修饰可以对CAR介导的杀伤产生显着影响。考虑到 CAR 结构的每个部分都有许多不同的选项，因此有大量的排列。制造CAR-T细胞是一个耗时且昂贵的过程，制造和测试许多构建体是一项大量的时间和材料投资。该协议描述了一个平台，用于快速评估 Jurkat 细胞 （CAR-J） 中铰链优化的 CAR 构建体。Jurkat 细胞是一种永生化的 T 细胞系，具有高慢病毒摄取量，可实现高效的 CAR 转导。在这里，我们提出了一个使用荧光成像仪快速评估 CAR-J 的平台，然后确认 PBMC 衍生的 T 细胞的细胞溶解。

引言

据美国国家癌症研究所¹ 报道，CAR-T 细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出巨大的前景，自 2017 年以来，FDA 批准了 6 种 CAR-T 产品。有许多CAR-T细胞在临床试验中用于靶向实体瘤。设计新的CAR靶点和优化CAR结构对于CAR-T细胞的功效至关重要。为每种应用选择理想的 CAR 构建体对于准确靶向肿瘤相关抗原 （TAA） 至关重要，同时避免正常组织中 TAA 表达水平低²。

CAR 构建体主要由五个区室组成：（1） 靶向肿瘤抗原的细胞外单链可变片段 （scFv） 结构域;（2）铰链域;（3）跨膜结构域;（4）细胞内细胞质T细胞共刺激结构域;（5）信令域。修改这些结构域中的每一个都会影响 CAR-T 细胞与其靶细胞^{结合的精度 3}。因此，评估这些CAR构建体的细胞毒性和交叉反应性对于选择正确的构建体进行体内实验至关重要。目前评估 T 细胞溶解的方法包括 ⁵¹Cr 释放试验、乳酸脱氢酶释放试验、生物发光成像试验、基于实时阻抗的细胞分析和基于细胞的流式细胞术试验 ^4,5。这里描述的基于荧光成像的平台可识别活细胞与死细胞的数量，这是对 T 细胞溶解的直接定量，而不是评估 T 细胞溶解的间接方法。

这是一种简单、经济高效、快速且高通量的技术，只需最少的干预，即可评估表达表皮生长因子受体 （EGFR） CAR 的 Jurkat 细胞对 MDA-MB-231 三阴性乳腺癌 （TNBC） 细胞和 EGFR CRISPR 敲除 MDA-MB-231 细胞的细胞毒性。Jurkat 细胞是永生化的人 T 淋巴细胞⁶，已被广泛用于研究 T 细胞活化和信号转导机制⁷。此外，Jurkat 细胞已在多项研究^{8、9、10、11} 中用于体外 CAR 测试。Jurkat 细胞很容易被慢病毒转导并具有持续的增殖，该系统被用于优化各种 EGFR CAR 构建体的铰链结构域。

该测定可用于筛选靶向各种肿瘤抗原的多种CAR构建体，并用于对抗多种贴壁肿瘤细胞系和各种效应子与肿瘤（E：T）比率。此外，可以评估多个时间点，并且可以修改重复次数，以确定各种CAR构建体中的最佳杀伤。需要使用外周血单核细胞 （PBMC） 衍生的 CD3 T 细胞来确认最佳构建体。开发这种方法的总体目标是以高通量方式快速优化CAR铰链几何形状，克服转导效率低等障碍，然后在PBMC衍生的T细胞中得到确认。

研究方案

注意：所有细胞培养工作均在生物安全柜中完成，并配有实验室外套、手套并遵循标准无菌技术。

1. 生成表达 CAR 的 Jurkats （CAR-J）

1. 购买 Jurkat 细胞，从 ATCC 克隆 E6-1。在 T-75 烧瓶中解冻 1 x 10⁶ 个细胞，并在 T-75 烧瓶中培养。使用补充有10%FBS的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基在37°C和5%CO₂的培养箱中，以0.6×10⁶个细胞/mL的悬浮液维持它们。
2. 培养板 1 x 10 5 个 Jurkat 细胞，每孔组织培养物处理 24 孔板，在含有 4 μg/mL 聚凝胺的 500 μL RPMI 生长培养基中，可提高慢病毒效率。使用基于激光的荧光检测台式细胞分析仪对细胞进行计数。孔的数量取决于要评估的结构数量。此示例将使用 4 个构造和一个未转导的控件。CAR结构设计如表1所示。
3. 每个CAR构建体中加入10μL慢病毒/孔。CAR构建体设计和慢病毒生产如前所述¹²。
4. 第二天，向每个孔中加入1mL生长RPMI培养基，并继续在37°C的培养箱中用5%CO₂培养。
5. 2 天后（Jurkat 转导后总共 72 小时）收集细胞并计数。
6. 取 1 x 10⁴ 个细胞进行流动，以确认 Jurkat 细胞上的 CAR 表达。简而言之，用FACS染色溶液（FSS）洗涤细胞2次，然后用靶向用于检测CAR阳性的抗体标记CAR-J，用于在4°C的黑暗中检测CAR阳性30分钟。 用FSS再次洗涤2x，并如前所述通过流式细胞仪运行细胞¹²。按照制造商的建议使用抗体浓度。
7. Jurkat 细胞易于转导，几乎总是显示 >90% 的 CAR 表达。在共培养细胞毒性测定之前很久就生产 CAR-J 并冷冻以备后用。

2.铺板CFSE标记的肿瘤细胞

注意：MDA-MB-231（来自ATCC，HTB-26）细胞是合作者的礼物，EGFR KO MDA-MB-231如前所述¹²。

1. 在 T-75 烧瓶中解冻 1 x 10⁶ 个细胞，并在 T-75 烧瓶中培养。将MDA-MB-231肿瘤细胞和CRISPR EGFR KO MDA-MB-231肿瘤细胞维持在14mL补充有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中，在37°C的培养箱中用5%CO₂ 进行，并在约70%汇合时分裂。
2. 在常规明场显微镜下观察贴壁肿瘤细胞，以确保近70%的汇合。
3. 使用血清移液管从烧瓶中取出生长培养基。向T75烧瓶中加入3mL胰蛋白酶，并置于37°C的5%CO₂ 培养箱中3-5分钟，使细胞从烧瓶中分离。
4. 使用等量（3mL）生长培养基中和胰蛋白酶。将细胞悬液收集在离心管中，并以400× g 旋转细胞4分钟以沉淀细胞。
5. 使用移液管弃去上清液，并将细胞重悬于2mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。使用细胞计数器测定细胞浓度。
6. 将 8 x 10⁵ 个细胞转移到另一个 15 mL 试管中，并加入 PBS 使其体积为 1 mL。
7. 向每个试管中加入 2 μL 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE;5 μM 储备浓度），并使用 1 mL 移液管充分混合。
8. 将细胞与CFSE在37°C的培养箱中用5%CO₂孵育20分钟。20分钟后从培养箱中取出试管，并向试管中加入5mL生长培养基。
9. 将试管以400× g 离心4分钟，以沉淀CFSE标记的细胞。使用移液管弃去上清液，并加入 1 mL 新鲜培养基以重悬细胞。
10. 使用细胞计数器重新评估细胞浓度。将 4 x 10⁵ 个细胞转移到 25 mL 试剂储液槽中，并加入培养基，总体积为 8 mL。
    1. 为确保在100μL培养基中接种5000个肿瘤细胞/孔的足够体积，体积需要能够使用多通道移液器移液，并补偿步骤1.7中少数细胞的损失，准备10%-20%的额外细胞和培养基体积。
11. 使用 5 mL 血清移液管彻底混合细胞悬液。使用100 μL多通道移液管，将100 μL细胞悬液移液到每排透明平底黑色96孔板的左半部分。样品电镀策略见 表2。
12. 同样在板的右半部分移液EGFR KO细胞。将整个板铺好后，在组织培养罩平台上来回和左右拖动板，以确保肿瘤细胞在孔中的均匀分布。
13. 将板在37°C的培养箱中用5%CO₂ 孵育4小时，以便肿瘤细胞附着。

3. 共培养表达 CAR 的 Jurkats 与 CFSE 标记的肿瘤细胞

1. 使用未转导和表达 CAR 的 Jurkat 细胞的计数，将每个 CAR-J 的 4 x 10⁵ 个细胞转移到 25 mL 储液槽中。加入 DMEM 生长培养基，总体积为 2 mL。
2. 对于 4：1 的 E：T，每孔在 100 μL 培养基中加入 2 x 10⁴ 个 CAR-J，使用多通道移液管沿着每个孔的侧面轻轻移动，以免干扰附着的肿瘤细胞。
3. 使用多通道移液器将另外 100 μL 生长培养基添加到含有肿瘤细胞和 Jurkat 细胞的孔的一侧。仅肿瘤组获得 200 μL 培养基，使其在所有孔中总共获得 300 μL 培养基。
4. 沿着平台来回和左右运动拖动板，以确保 Jurkat 细胞在肿瘤细胞上的均匀分布。
5. 在37°C的培养箱中用5%CO₂ 共培养48小时。

4. 成像板的制备

1. 根据孔数在低背景荧光培养基中以 1 μg/mL 制备碘化丙啶 （PI） 溶液，每个孔获得 100 μL 培养基。
2. 对于 84 个孔，制备 9 mL 含有 PI 的培养基。使用移液管彻底混合培养基。
3. 用去离子水稀释 Triton-X 制备 10 mL 20% Triton-X 溶液。共培养48小时后，通过单次倒置板并在纸巾上敲击来弃去含有CAR-J的上清液。
4. 现在，使用多通道移液管将100μL上述制备的含有PI的培养基（步骤4.2）轻轻加入每个孔中，以免干扰粘附的肿瘤细胞。
5. 将 20 μL 20% Triton-X 溶液加入每种肿瘤类型的第一个孔中，作为完全死亡对照。
6. 将板留在培养箱中20分钟。使用荧光成像流式细胞仪对板进行成像。数据存储在计算机上，以后可以进行分析。

5. 分析荧光图像

1. 使用肿瘤细胞中的一个孔来设置绿色荧光通道。
2. 将孔掩模降低到 98%，以去除孔边缘的细胞，因为边缘的信号不完美。
3. 在绿色荧光 CFSE 通道上识别 CFSE 标记的肿瘤细胞。修改荧光强度阈值以拾取孔上的所有细胞。
4. 将最小细胞直径设置为25μm，以去除在CFSE通道上检测到的任何碎片。这取决于所分析的细胞类型。
5. 启用 单独的触摸对象 ，以在单个单元格相互接触时对其进行识别。
6. 在图像显示屏上选择 CFSE ，然后查看图形叠加，以确定系统正在选取的内容。
7. 一旦正确拾取CFSE标记的细胞，设置门来定义活细胞群和死细胞群。
8. 选择 CFSE 标记的单元格，生成 y 轴上的计数直方图与 x 轴上的平均 PI 强度。
9. 根据我们添加Triton-X的孔（步骤4.5），绘制一个分离器来区分低PI染色细胞和高PI染色细胞。该孔应将大部分细胞置于高 PI 染色区域。
   注意：PI 显示活细胞上的基础信号。因此，添加Triton-X会杀死所有细胞，并且它们在红色荧光通道中染色明亮。这有助于绘制门以将死细胞与活细胞分离。
10. 调整 x 轴值以便能够更好地查看单元格。现在将低 PI 染色细胞标记为活细胞。
11. 选择“活动单元格”，设置另一个直方图，其面积位于 x 轴上，计数在 y 轴上。
12. 使用肿瘤绘制另一个分裂器，仅捕获细胞而不是碎片。Jurkat 处理过的井将开始积聚碎屑，这些碎屑将被 CFSE 染色，需要从计数中清除。其余的非碎片被标记为“大细胞”。
13. 对整个板运行分析，并导出包含数字的电子表格。
14. 绘制大计数图以确定暴露于 CAR-J 后孔中剩余的活 CFSE 标记肿瘤细胞的数量。使用单因素方差分析确定统计量。

结果

在 72 小时时评估了 CAR-J1 的 E：T 比值范围在 1：8 和 8：1 之间，靶向 TNBC MDA-MB-231 细胞上的 EGFR。用含有聚凝胺的CAR慢病毒转导Jurkat细胞以产生CAR-J细胞，如步骤2所述。CAR-J1的细胞毒性随着E：T比值的增加而显著增加，而在1：8的比例下杀伤率没有差异（图1）。在 72 小时内以 4：1 E：T 观察到超过 50% 的杀伤率。该 E：T 用于后续实验，持续时间缩短至 48 小时，用于对多种 CAR ?...

讨论

在这里，我们提出了一种快速方法来有效地评估 Jurkat 细胞中 CAR 表达诱导的靶标特异性细胞溶解活性。所有 CAR 构建体具有相同的 scFv，但不同的铰链和跨膜结构域，这些结构域已被证明会影响 CAR-T 细胞的效力¹³。通过用抗原敲除 （KO） 细胞培养这些 CAR-J 来进一步评估这些 CAR-J 的非特异性杀伤。这表明杀伤是肿瘤抗原特异性的，而不是由于 CAR-J 的基础激活。可以很容易地确定?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work