Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

Riepilogo

Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.

Abstract

Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) sono all'avanguardia in oncologia. Una CAR è costituita da un dominio di targeting (di solito un frammento variabile a catena singola, scFv), con un linker intra-catena di accompagnamento, seguito da un dominio cerniera, transmembrana e costimolatorio. La modifica del linker intra-catena e del dominio della cerniera può avere un effetto significativo sull'uccisione mediata da CAR. Considerando le molte opzioni diverse per ogni parte di un costrutto CAR, esiste un gran numero di permutazioni. La produzione di celle CAR-T è un processo lungo e costoso e la realizzazione e il collaudo di molti costrutti richiede un notevole investimento in termini di tempo e materiali. Questo protocollo descrive una piattaforma per valutare rapidamente i costrutti CAR ottimizzati per cerniera nelle cellule Jurkat (CAR-J). Le cellule Jurkat sono una linea di cellule T immortalizzate con un elevato assorbimento di lentivirus, che consente un'efficiente trasduzione delle CAR. Qui, presentiamo una piattaforma per valutare rapidamente CAR-J utilizzando un imager fluorescente, seguito dalla conferma della citolisi nelle cellule T derivate da PBMC.

Introduzione

La terapia cellulare CAR-T si è dimostrata molto promettente nelle neoplasie ematologiche, come evidenziato dai 6 prodotti CAR-T approvati dalla FDA dal 2017, come riportato dal National Cancer Institute¹. Ci sono numerose cellule CAR-T negli studi clinici per colpire i tumori solidi. La progettazione di nuovi bersagli CAR e l'ottimizzazione del costrutto CAR sono fondamentali per l'efficacia di una cellula CAR-T. La scelta del costrutto CAR ideale per ogni applicazione è essenziale per un targeting accurato degli antigeni associati al tumore (TAA), evitando al contempo bassi livelli di espressione di TAA nei tessuti normali^2<....

Protocollo

NOTA: Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in una cabina di biosicurezza con camice da laboratorio, guanti e seguendo le tecniche asettiche standard.

1. Generazione di Jurkats che esprimono CAR (CAR-J)

1. Acquista le celle Jurkat, clona E6-1 da ATCC. Scongelare 1 x 10⁶ cellule in un pallone T-75 e coltivarle in un pallone T-75. Mantenerli in sospensione a 0,6 x 10⁶ cellule per mL utilizzando terreni di trattamento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrati con FBS al 10% in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ .
2. Piastra 1 x 10⁵ cellule Jurka....

Discussione

Qui abbiamo proposto un metodo rapido per valutare in modo efficiente l'attività citolitica target-specifica indotta dall'espressione di CAR nelle cellule Jurkat. Tutti i costrutti CAR hanno lo stesso scFv ma diversi domini cerniera e transmembrana che hanno dimostrato di influenzare la potenza delle cellule CAR-T¹³. Un'ulteriore valutazione dell'uccisione non specifica da parte di queste CAR-J è stata effettuata coltivandole con cellule knock out dell'antigene (KO). Ciò dimostra che l'uccision.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work