Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

Riepilogo

Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.

Abstract

Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) sono all'avanguardia in oncologia. Una CAR è costituita da un dominio di targeting (di solito un frammento variabile a catena singola, scFv), con un linker intra-catena di accompagnamento, seguito da un dominio cerniera, transmembrana e costimolatorio. La modifica del linker intra-catena e del dominio della cerniera può avere un effetto significativo sull'uccisione mediata da CAR. Considerando le molte opzioni diverse per ogni parte di un costrutto CAR, esiste un gran numero di permutazioni. La produzione di celle CAR-T è un processo lungo e costoso e la realizzazione e il collaudo di molti costrutti richiede un notevole investimento in termini di tempo e materiali. Questo protocollo descrive una piattaforma per valutare rapidamente i costrutti CAR ottimizzati per cerniera nelle cellule Jurkat (CAR-J). Le cellule Jurkat sono una linea di cellule T immortalizzate con un elevato assorbimento di lentivirus, che consente un'efficiente trasduzione delle CAR. Qui, presentiamo una piattaforma per valutare rapidamente CAR-J utilizzando un imager fluorescente, seguito dalla conferma della citolisi nelle cellule T derivate da PBMC.

Introduzione

La terapia cellulare CAR-T si è dimostrata molto promettente nelle neoplasie ematologiche, come evidenziato dai 6 prodotti CAR-T approvati dalla FDA dal 2017, come riportato dal National Cancer Institute¹. Ci sono numerose cellule CAR-T negli studi clinici per colpire i tumori solidi. La progettazione di nuovi bersagli CAR e l'ottimizzazione del costrutto CAR sono fondamentali per l'efficacia di una cellula CAR-T. La scelta del costrutto CAR ideale per ogni applicazione è essenziale per un targeting accurato degli antigeni associati al tumore (TAA), evitando al contempo bassi livelli di espressione di TAA nei tessuti normali².

Un costrutto CAR è costituito principalmente da cinque compartimenti: (1) dominio extracellulare a frammento variabile a catena singola (scFv) che ha come bersaglio l'antigene tumorale; (2) dominio cerniera; (3) dominio transmembrana; (4) dominio costimolatorio delle cellule T citoplasmatiche intracellulari; e (5) dominio di segnalazione. La modifica di ciascuno di questi domini influisce sulla precisione della cellula CAR-T che interagisce con la sua cellula bersaglio³. Pertanto, la valutazione della citotossicità e della cross-reattività di questi costrutti CAR in vitro è fondamentale per scegliere il costrutto giusto per progredire verso gli esperimenti in vivo. Gli attuali metodi di valutazione della citolisi da parte delle cellule T includono il test di rilascio di ⁵¹Cr, il test di rilascio della lattato deidrogenasi, il test di imaging bioluminescente, l'analisi cellulare basata sull'impedenza in tempo reale e il test di citometria a flusso cellulare ^4,5. La piattaforma basata sull'imaging fluorescente qui descritta identifica il numero di cellule vive rispetto a quelle morte, che è una quantificazione diretta della citolisi delle cellule T in contrapposizione a un metodo indiretto di valutazione della citolisi da parte delle cellule T.

Ecco una tecnica semplice, economica, rapida e ad alto rendimento con un intervento minimo per valutare la citotossicità delle cellule Jurkat che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) CAR contro le cellule di carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) MDA-MB-231 e le cellule MDA-MB-231 knock out EGFR CRISPR. Le cellule Jurkat sono cellule dei linfociti T umani immortalizzate⁶ che sono state ampiamente utilizzate per studiare l'attivazione delle cellule T e i meccanismi di segnalazione⁷. Inoltre, le cellule Jurkat sono state utilizzate per test CAR in vitro in diversi studi 8,9,10,11. Le cellule Jurkat sono facilmente trasdotte dai lentivirus e hanno una proliferazione sostenuta, e questo sistema è stato sfruttato per ottimizzare il dominio cerniera di vari costrutti EGFR CAR.

Questo test può essere utilizzato per lo screening di più costrutti CAR mirati a vari antigeni tumorali e utilizzato contro più linee cellulari tumorali aderenti e in vari rapporti effettore/tumore (E:T). Inoltre, è possibile valutare più punti temporali e modificare il numero di repliche per identificare la migliore uccisione tra i vari costrutti CAR. I migliori costrutti devono essere confermati utilizzando cellule T CD3 derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). L'obiettivo generale alla base dello sviluppo di questo metodo è quello di ottimizzare rapidamente la geometria della cerniera CAR in modo ad alto rendimento, superando barriere come la bassa efficienza di trasduzione, seguita dalla conferma nelle cellule T derivate da PBMC.

Protocollo

NOTA: Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in una cabina di biosicurezza con camice da laboratorio, guanti e seguendo le tecniche asettiche standard.

1. Generazione di Jurkats che esprimono CAR (CAR-J)

1. Acquista le celle Jurkat, clona E6-1 da ATCC. Scongelare 1 x 10⁶ cellule in un pallone T-75 e coltivarle in un pallone T-75. Mantenerli in sospensione a 0,6 x 10⁶ cellule per mL utilizzando terreni di trattamento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrati con FBS al 10% in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ .
2. Piastra 1 x 10⁵ cellule Jurkat per pozzetto di una coltura tissutale trattata Piastra a 24 pozzetti in 500 μL di terreno di crescita RPMI contenente 4 μg/mL di polibrone che migliora l'efficienza lentivirale. Conta le cellule utilizzando un analizzatore di cellule da banco a rilevamento fluorescente basato su laser. Il numero di pozzetti dipende dal numero di costrutti da valutare. In questo esempio verranno utilizzati 4 costrutti e un controllo non trasdotto. Il progetto del costrutto CAR è mostrato nella Tabella 1.
3. Aggiungere 10 μL di lentivirus/pozzetto di ciascun costrutto CAR. La progettazione del costrutto CAR e la produzione di lentivirus sono stati eseguiti come descritto in precedenza¹².
4. Il giorno successivo aggiungere 1 mL di terreno RPMI di crescita a ciascun pozzetto e continuare la coltura nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ .
5. Raccogliere le cellule 2 giorni dopo (in totale 72 ore dopo la trasduzione di Jurkat) e contarle.
6. Prelevare 1 x 10⁴ celle per il flusso in esecuzione per confermare l'espressione di CAR sulle cellule Jurkat. Lavare brevemente le cellule 2 volte con la soluzione colorante FACS (FSS) prima di marcare la CAR-J con anticorpi mirati al tag Flag utilizzato per rilevare la positività alla CAR per 30 minuti al buio a 4 °C. Lavare di nuovo 2 volte con FSS e far passare le cellule attraverso un citometro a flusso come descritto in precedenza¹². Utilizzare la concentrazione di anticorpi come raccomandato dal produttore.
7. Le cellule Jurkat sono facilmente trasducibili e quasi sempre mostrano un'espressione di CAR del >90%. Produrre CAR-J molto prima del test di citotossicità in co-coltura e congelare per un uso successivo.

2. Placcatura di cellule tumorali marcate con CFSE

NOTA: Le celle MDA-MB-231 (da ATCC, HTB-26) sono state un regalo di un collaboratore e EGFR KO MDA-MB-231 sono state create come descritto in precedenza¹².

1. Scongelare 1 x 10⁶ cellule in un pallone T-75 e coltivarle in un pallone T-75. Mantenere le cellule tumorali MDA-MB-231 e le cellule tumorali CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 in 14 mL di terreno alterato dell'aquila di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂ e diviso quando circa il 70% è confluente.
2. Osservare le cellule tumorali aderenti al normale microscopio in campo chiaro per garantire una confluenza di quasi il 70%.
3. Rimuovere il terreno di coltura dal matraccio utilizzando una pipetta sierologica. Aggiungere 3 mL di tripsina nel matraccio T75 e porre in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 3-5 minuti per staccare le cellule dal pallone.
4. Neutralizzare la tripsina utilizzando una quantità uguale (3 ml) di terreno di coltura. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugare le cellule a 400 x g per 4 minuti per pellettizzare le cellule.
5. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule.
6. Trasferire 8 x 10⁵ cellule in un'altra provetta da 15 mL e aggiungere PBS per ottenere un volume di 1 mL.
7. Aggiungere 2 μL di carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE; concentrazione madre 5 μM) in ciascuna provetta e mescolare bene utilizzando una pipetta da 1 mL.
8. Incubare le cellule con CFSE per 20 minuti nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ . Rimuovere le provette dall'incubatrice dopo 20 minuti e aggiungere 5 ml di terreno di coltura alla provetta.
9. Centrifugare le provette a 400 x g per 4 minuti per pellettizzare le cellule marcate con CFSE. Scartare il surnatante usando una pipetta e aggiungere 1 mL di terreno fresco per risospendere le cellule.
10. Rivalutare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule. Trasferire 4 x 10⁵ cellule in un serbatoio di reagenti da 25 mL e aggiungere il terreno per un volume totale di 8 mL.
    1. Per garantire un volume sufficiente per seminare 5000 cellule tumorali/pozzetto in 100 μL di terreno, volume necessario per poter pipettare utilizzando la pipetta multicanale e per compensare la perdita di alcune cellule durante la fase 1.7, preparare il 10%-20% in più di cellule e volume del terreno.
11. Miscelare accuratamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml. Utilizzando una pipetta multicanale da 100 μL, pipettare 100 μL di sospensione cellulare in ciascuna fila della piastra nera trasparente a fondo piatto da 96 pozzetti sulla metà sinistra. Un esempio di strategia di placcatura è riportato nella Tabella 2.
12. Pipettare le cellule EGFR KO in modo simile sulla metà destra della piastra. Una volta che l'intera piastra è stata placcata, trascinarla avanti e indietro e da un lato all'altro sulla piattaforma della cappa di coltura tissutale per garantire una distribuzione uniforme delle cellule tumorali nei pozzetti.
13. Incubare la piastra per 4 ore nell'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂ per consentire l'adesione delle cellule tumorali.

3. Co-coltura di Jurkats che esprimono CAR con cellule tumorali marcate con CFSE

1. Utilizzando la conta delle cellule Jurkat non trasdotte ed esprimenti CAR, trasferire 4 x 10⁵ cellule di ciascuna CAR-J in un serbatoio da 25 mL. Aggiungere il terreno di coltura DMEM per un volume totale di 2 ml.
2. Per E:T di 4:1, sono stati aggiunti 2 x 10⁴ CAR-J per pozzetto in 100 μL di terreno utilizzando una pipetta multicanale delicatamente lungo il lato di ciascun pozzetto in modo da non disturbare le cellule tumorali attaccate.
3. Aggiungere altri 100 μL di terreno di coltura utilizzando una pipetta multicanale sul lato dei pozzetti contenenti cellule tumorali e cellule Jurkat. I gruppi tumorali ricevono solo 200 μL di terreno per un totale di 300 μL di terreno in tutti i pozzetti.
4. Trascinare la piastra lungo la piattaforma avanti e indietro e con movimenti da un lato all'altro per garantire una distribuzione uniforme delle cellule Jurkat sulle cellule tumorali.
5. Lasciare la cocoltura nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.

4. Preparazione della piastra per l'imaging

1. Preparare una soluzione di ioduro di propidio (PI) a 1 μg/mL in terreni a fluorescenza a basso fondo in base al numero di pozzetti e ciascuno ottenendo 100 μL di terreno.
2. Per 84 pozzetti preparare 9 mL di terreno contenente PI. Miscelare accuratamente il terreno con una pipetta.
3. Preparare 10 mL di soluzione di Triton-X al 20% diluendo Triton-X con acqua deionizzata. Dopo 48 ore di cocoltura, scartare il surnatante contenente CAR-J con una singola inversione della piastra e picchiettando su carta assorbente.
4. A questo punto, aggiungere 100 μL di terreno preparato sopra (passaggio 4.2) contenente PI in ciascun pozzetto utilizzando delicatamente una pipetta multicanale in modo da non disturbare le cellule tumorali aderenti.
5. Aggiungere 20 μL di soluzione Triton-X al 20% al primo pozzetto di ciascun tipo di tumore che funziona come un controllo totale dei morti.
6. Lasciare la piastra nell'incubatrice per 20 min. Eseguire l'imaging della piastra utilizzando il citometro a fluorescenza. I dati vengono memorizzati sul computer e possono essere analizzati in un secondo momento.

5. Analisi di immagini fluorescenti

1. Utilizzare uno dei pozzi tumorali solo delle cellule per impostare il canale fluorescente verde.
2. Diminuire la maschera del pozzetto al 98% per rimuovere le celle sul bordo del pozzetto poiché il segnale non è perfetto sul bordo.
3. Identifica le cellule tumorali marcate con CFSE sul canale CFSE verde e fluorescente. Modificare il valore della soglia di intensità della fluorescenza per prelevare tutte le cellule sul pozzetto.
4. Impostare il diametro minimo della cella su 25 μm per rimuovere eventuali detriti rilevati sul canale CFSE. Questo varia a seconda del tipo di cellula analizzata.
5. Abilita Separa oggetti a contatto per identificare le singole celle quando sono in contatto tra loro.
6. Selezionare CFSE nella visualizzazione dell'immagine e osservare la sovrapposizione grafica per capire cosa viene selezionato dal sistema.
7. Una volta che le cellule marcate con CFSE vengono prelevate correttamente, impostare i cancelli per definire la popolazione di cellule vive rispetto a quelle morte.
8. Selezionando le celle marcate CFSE, generare un istogramma di conteggi sull'asse y rispetto all'intensità PI media sull'asse x.
9. Sulla base del pozzetto in cui abbiamo aggiunto Triton-X (passaggio 4.5), disegna uno splitter per differenziare le cellule colorate con PI basso da quelle colorate con PI alto. Questo pozzetto dovrebbe avere la maggior parte delle cellule in una regione ad alto PI colorato.
   NOTA: PI mostra il segnale basale sulle cellule vive. Quindi, l'aggiunta di Triton-X uccide tutte le cellule e queste si colorano nel canale fluorescente rosso. Ciò facilita l'apertura di cancelli per separare le cellule morte dalle cellule vive.
10. Regolare il valore dell'asse x per visualizzare meglio le celle. Ora etichettare le cellule a basso PI come cellule vive.
11. Selezionando le celle vive, imposta un altro istogramma con area sull'asse x e conteggi sull'asse y.
12. Disegna un altro splitter usando bene solo il tumore per catturare le cellule e non i detriti. I pozzi trattati con Jurkat inizieranno ad accumulare detriti che saranno colorati con CFSE e dovranno essere rimossi dai conteggi. I rimanenti non detriti sono etichettati come "Big cells".
13. Eseguire l'analisi sull'intera piastra ed esportare il foglio di calcolo contenente i numeri.
14. Tracciare i conteggi Big per identificare il numero di cellule tumorali vive marcate con CFSE rimaste nel pozzetto dopo l'esposizione a CAR-J. Determinare le statistiche utilizzando l'ANOVA unidirezionale.

Risultati

È stato valutato un intervallo di rapporto E:T compreso tra 1:8 e 8:1 per CAR-J1 a 72 ore, che ha come target l'EGFR sulle cellule TNBC MDA-MB-231. Le cellule Jurkat sono state trasdotte con lentivirus CAR con polibrene per generare cellule CAR-J come descritto nella fase 2. La citotossicità di CAR-J1 è aumentata significativamente con un rapporto E:T più elevato senza alcuna differenza nell'uccisione con un rapporto 1:8 (Figura 1). Più del 50% delle uccisioni è stato osservato a 4:1 E...

Discussione

Qui abbiamo proposto un metodo rapido per valutare in modo efficiente l'attività citolitica target-specifica indotta dall'espressione di CAR nelle cellule Jurkat. Tutti i costrutti CAR hanno lo stesso scFv ma diversi domini cerniera e transmembrana che hanno dimostrato di influenzare la potenza delle cellule CAR-T¹³. Un'ulteriore valutazione dell'uccisione non specifica da parte di queste CAR-J è stata effettuata coltivandole con cellule knock out dell'antigene (KO). Ciò dimostra che l'uccision...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work