JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.

Аннотация

Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) находятся на переднем крае онкологии. CAR состоит из целевого домена (обычно фрагмента переменной цепи, scFv) с сопутствующим внутрицепочечным линкером, за которым следуют шарнирный, трансмембранный и костимулирующий домены. Модификация внутрицепочечного линкера и шарнирного домена может оказать существенное влияние на CAR-опосредованное убийство. Принимая во внимание множество различных вариантов для каждой части конструкции CAR, существует большое количество перестановок. Изготовление CAR-T-клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом, а изготовление и тестирование многих конструкций требует больших временных и материальных затрат. Этот протокол описывает платформу для быстрой оценки шарнирно-оптимизированных конструкций CAR в ячейках Jurkat (CAR-J). Клетки Jurkat представляют собой иммортализированную линию Т-клеток с высоким поглощением лентивируса, что обеспечивает эффективную трансдукцию CAR. Здесь мы представляем платформу для быстрой оценки CAR-J с помощью флуоресцентного тепловизора с последующим подтверждением цитолиза в Т-клетках, полученных из PBMC.

Введение

По даннымНационального института рака, с 2017 года CAR-T-клеточная терапия показала большие перспективы при гематологических злокачественных новообразованиях, о чем свидетельствуют 6 одобренных FDA продуктов CAR-T. Существует множество CAR-T-клеток, проводимых в клинических испытаниях для воздействия на солидные опухоли. Разработка новых мишеней для CAR и оптимизация конструкции CAR имеют жизненно важное значение для эффективности CAR-T-клеток. Выбор идеальной конструкции CAR для каждого применения имеет важное значение для точного нацеливания на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА) при одновременном избежании низких уровней экспрессии ТАА в нормальных тканях2.

Конструкция CAR в основном состоит из пяти компартментов: (1) внеклеточный одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), нацеленный на опухолевой антиген; (2) шарнирный домен; (3) трансмембранный домен; (4) внутриклеточный цитоплазматический Т-клеточный костимулирующий домен; и (5) сигнальная область. Модификация каждого из этих доменов влияет на точность взаимодействия CAR-T-клетки со своей клеткой-мишенью3. Следовательно, оценка цитотоксичности и перекрестной реактивности этих CAR-конструкций in vitro имеет решающее значение для выбора правильной конструкции для перехода к экспериментам in vivo. Современные методы оценки цитолиза Т-клетками включают анализ высвобождения 51Cr, анализ высвобождения лактатдегидрогеназы, анализ биолюминесцентной визуализации, анализ клеток на основе импеданса в реальном времени и анализ проточной цитометрии на основе клеток 4,5. Описанная здесь платформа, основанная на флуоресцентной визуализации, идентифицирует количество живых и мертвых клеток, что является прямой количественной оценкой цитолиза Т-клеток, в отличие от косвенного метода оценки цитолиза Т-клетками.

Вот простой, экономичный, быстрый и высокопроизводительный метод с минимальным вмешательством для оценки цитотоксичности клеток Jurkat, экспрессирующих рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) CAR, против клеток трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) MDA-MB-231, а EGFR CRISPR нокаутирует клетки MDA-MB-231. Клетки Jurkat представляют собой иммортализированные Т-лимфоцитарные клеткичеловека 6, которые широко используются для изучения активации Т-клеток и сигнальных механизмов7. Кроме того, клетки Jurkat использовались для тестирования in vitro CAR в нескольких исследованиях 8,9,10,11. Клетки Jurkat легко трансдуцируются лентивирусом и имеют устойчивую пролиферацию, и эта система была использована для оптимизации шарнирного домена различных конструкций EGFR CAR.

Этот анализ может быть использован для скрининга нескольких конструкций CAR, нацеленных на различные опухолевые антигены, и использоваться против нескольких адгезивных линий опухолевых клеток и в различных соотношениях эффекторов и опухолей (E:T). Кроме того, можно оценить несколько временных точек и изменить количество репликаций, чтобы определить лучшее убийство среди различных конструкций CAR. Наилучшие конструкции должны быть подтверждены с использованием CD3 Т-клеток, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Общая цель разработки этого метода заключается в быстрой оптимизации геометрии шарнира CAR с высокой пропускной способностью, преодолевая такие барьеры, как низкая эффективность трансдукции, с последующим подтверждением на Т-клетках, полученных из PBMC.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами выполняются в шкафу биобезопасности с лабораторным халатом, перчатками и в соответствии со стандартными асептическими методами.

1. Генерация CAR, выражающая юркаты (CAR-J)

  1. Приобретите ячейки Jurkat, клон E6-1 от ATCC. Разморозить 1 х 106 клеток в колбе Т-75 и культивировать их в колбах Т-75. Хранят их в суспензии при концентрации 0,6 x 10,6 клеток на мл, используя среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% FBS в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
  2. Планшет 1 x 105 клеток Jurkat на лунку обработанной тканевой культуры 24-луночный планшет в 500 мкл питательной среды RPMI, содержащей 4 мкг/мл полибрена, который повышает лентивирусную эффективность. Подсчитайте количество клеток с помощью лазерного флуоресцентного анализатора клеток. Количество скважин зависит от количества конструкций, подлежащих оценке. В этом примере будут использоваться 4 конструкции и нетрансдуцируемый элемент управления. Конструкция конструкции ЦАР приведена в таблице 1.
  3. Добавьте 10 мкл лентивируса на лунку каждого CAR-конструкта. Проектирование конструкции CAR и получение лентивируса выполнялось, как описано выше12.
  4. На следующий день добавьте в каждую лунку по 1 мл питательной среды RPMI и продолжайте культивирование в инкубаторе при температуре 37 °C с 5% CO2.
  5. Собирают клетки через 2 дня (всего через 72 ч после трансдукции Юрката) и подсчитывают их.
  6. Возьмем 1 х 104 ячейки для бегущего потока, чтобы подтвердить экспрессию CAR на клетках Jurkat. Короче говоря, промойте клетки 2 раза раствором для окрашивания FACS (FSS) перед маркировкой CAR-J антителами, нацеленными на метку Flag, используемой для определения положительного результата CAR, в течение 30 минут в темноте при температуре 4 °C. Еще раз промывают 2 раза с помощью FSS и пропускают клетки через проточный цитометр, как описано ранее12. Используйте концентрацию антител в соответствии с рекомендациями производителя.
  7. Клетки Jurkat легко трансдуцируются и почти всегда показывают экспрессию >90% CAR. Производят CAR-J задолго до проведения анализа на цитотоксичность в совместном культивировании и замораживают для последующего использования.

2. Покрытие опухолевых клеток, меченных CFSE

ПРИМЕЧАНИЕ: ЯЧЕЙКИ MDA-MB-231 (от ATCC, HTB-26) были подарком от коллаборанта, а EGFR KO MDA-MB-231 были созданы, как описано ранее12.

  1. Разморозить 1 х 106 клеток в колбе Т-75 и культивировать их в колбах Т-75. Поддерживайте опухолевые клетки MDA-MB-231 и опухолевые клетки CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 в 14 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2 и расщепляйте при слиянии примерно 70%.
  2. Наблюдайте за адгезивными опухолевыми клетками под обычным светлопольным микроскопом, чтобы обеспечить почти 70% слияние.
  3. Удалить питательную среду из колбы с помощью серологической пипетки. Добавьте 3 мл трипсина в колбу T75 и поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5% CO2 на 3-5 мин, чтобы отделить клетки от колбы.
  4. Нейтрализуют трипсин, используя равное количество (3 мл) питательной среды. Соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и открутите клетки со скоростью 400 x g в течение 4 минут, чтобы гранулировать клетки.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте клетки в 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Определите концентрацию клеток с помощью счетчика клеток.
  6. Переложите ячейки 8 x 105 в другую пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS, чтобы получить объем 1 мл.
  7. Добавьте 2 мкл карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE; концентрация 5 мкМ) в каждую пробирку и хорошо перемешайте с помощью пипетки объемом 1 мл.
  8. Инкубируют клетки с CFSE в течение 20 мин в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. Через 20 мин вынуть пробирки из инкубатора и добавить в пробирку 5 мл питательной среды.
  9. Центрифугируйте пробирки при 400 x g в течение 4 минут, чтобы гранулировать меченые ячейки CFSE. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и добавьте 1 мл свежей среды для ресуспендирования клеток.
  10. Переоцените концентрацию клеток с помощью счетчика клеток. Переложите ячейки 4 x 105 в резервуар для реагента объемом 25 мл и добавьте среду до общего объема 8 мл.
    1. Чтобы обеспечить достаточный объем для посева 5000 опухолевых клеток/лунку в 100 мкл среды, объем необходимо было пипетировать с помощью многоканальной пипетки, а для компенсации потери нескольких клеток на этапе 1.7 подготовить 10%-20% дополнительных клеток и объема среды.
  11. Тщательно перемешайте клеточную суспензию с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. Используя многоканальную пипетку на 100 мкл, пипетку по 100 мкл клеточной суспензии в каждый ряд прозрачной черной 96-луночной пластины с плоским дном в левой половине. Пример стратегии нанесения покрытия можно найти в таблице 2.
  12. Пипетку EGFR KO ячейки аналогично наносят на правую половину пластины. После того, как вся пластина будет покрыта, перетащите пластину вперед и назад и из стороны в сторону на платформе для культивирования тканей, чтобы обеспечить равномерное распределение опухолевых клеток в лунках.
  13. Инкубируйте планшет в течение 4 ч в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 для прикрепления опухолевых клеток.

3. Совместное культивирование CAR, экспрессирующих Jurkats, с опухолевыми клетками, меченными CFSE

  1. Используя подсчет нетрансдуцированных и экспрессирующих CAR клеток Jurkat, перенесите 4 x 105 клеток каждого CAR-J в резервуар объемом 25 мл. Добавьте питательную среду DMEM для общего объема 2 мл.
  2. Для E:T 4:1 добавляли 2 x 104 CAR-J на лунку в 100 мкл среды с помощью многоканальной пипетки осторожно вдоль борта каждой лунки, чтобы не повредить прикрепленные опухолевые клетки.
  3. Добавьте еще 100 мкл питательной среды с помощью многоканальной пипетки к стенкам лунок, содержащих опухолевые клетки и клетки Юрката. Группы, больные только опухолями, получают 200 мкл среды, что в общей сложности составляет 300 мкл среды во всех лунках.
  4. Перетащите пластину по платформе вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток Юрката на опухолевых клетках.
  5. Выдерживают посев в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%СО2 в течение 48 ч.

4. Подготовка пластины к визуализации

  1. Раствор йодида пропидия (PI) в концентрации 1 мкг/мл в низкофоновых флуоресцентных средах в расчете на количество лунок и получение 100 мкл среды в каждой.
  2. Для 84 лунок готовят 9 мл среды, содержащей ПИ. Тщательно перемешайте среду с помощью пипетки.
  3. Приготовьте 10 мл 20% раствора Тритона-Х, разбавив Тритон-Х деионизированной водой. После 48 ч совместной культуры выбросьте надосадочную жидкость, содержащую CAR-J, однократным переворачиванием пластины и постукиванием по бумажному полотенце.
  4. Теперь добавьте в каждую лунку 100 мкл подготовленной выше подготовленной среды (шаг 4.2), содержащей ПИ, с помощью многоканальной пипетки осторожно, чтобы не потревожить прилипшие опухолевые клетки.
  5. Добавьте 20 мкл 20% раствора Тритона-Х в первую лунку каждого типа опухоли, которая функционирует как полный мертвый контроль.
  6. Оставьте тарелку в инкубаторе на 20 минут. Визуализируйте планшет с помощью флуоресцентного цитометра. Данные хранятся на компьютере и могут быть проанализированы позже.

5. Анализ флуоресцентных изображений

  1. Используйте одну из опухолевых лунок клеток, чтобы установить зеленый флуоресцентный канал.
  2. Уменьшите маску лунки до 98%, чтобы удалить ячейки на краю лунки, так как сигнал на краю не идеален.
  3. Идентификация меченых опухолевых клеток CFSE на зеленом флуоресцентном канале CFSE. Измените пороговое значение интенсивности флуоресценции, чтобы захватить все ячейки на лунке.
  4. Установите минимальный диаметр ячейки на 25 мкм, чтобы удалить любой мусор, обнаруженный на канале CFSE. Это зависит от типа анализируемой клетки.
  5. Включите параметр «Разделять соприкасающиеся объекты », чтобы идентифицировать отдельные ячейки, когда они соприкасаются друг с другом.
  6. Выберите CFSE на дисплее изображения и посмотрите на графическое наложение, чтобы понять, что выбирается системой.
  7. После того, как клетки, помеченные CFSE, будут должным образом отобраны, установите ворота для определения популяции живых и мертвых клеток.
  8. Выбрав ячейки, помеченные CFSE, постройте гистограмму отсчетов по оси Y от средней интенсивности ПИ по оси X.
  9. На основе лунки, в которую мы добавили Triton-X (шаг 4.5), нарисуйте разветвитель для дифференциации клеток с низким и высоким PI-окрашиванием. В этой лунке должна быть большая часть клеток в области с высоким ПИ-окрашиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PI показывает базальный сигнал на живых клетках. Следовательно, добавление Triton-X убивает все клетки, и они ярко окрашиваются в красный флуоресцентный канал. Это облегчает вытягивание ворот для отделения мертвых клеток от живых.
  10. Отрегулируйте значение оси X, чтобы лучше просматривать ячейки. Теперь обозначьте клетки с низким PI-окрашиванием как живые клетки.
  11. Выделив живые ячейки, задайте еще одну гистограмму с площадью по оси x и отсчетом по оси y.
  12. Нарисуйте еще один разветвитель, используя только опухоль, чтобы захватить клетки, а не мусор. В скважинах, обработанных Юркатом, начнет скапливаться мусор, который будет окрашен CFSE и должен быть удален из учета. Остальные, не являющиеся мусором, помечены как «Большие ячейки».
  13. Запустите анализ на всей пластине и экспортируйте электронную таблицу, содержащую числа.
  14. Постройте график больших подсчетов, чтобы определить количество живых опухолевых клеток, меченных CFSE, оставшихся в лунке после воздействия CAR-J. Определяйте статистику с помощью одностороннего ANOVA.

Результаты

Диапазон соотношения E:T от 1:8 до 8:1 для CAR-J1 был оценен через 72 ч, который был нацелен на EGFR на клетках TNBC MDA-MB-231. Клетки Jurkat трансдуцировали лентивирусом CAR с полибреном для получения клеток CAR-J, как описано на шаге 2. Цитотоксичность CAR-J1 достоверно увеличивалась при более высоком соотношени...

Обсуждение

Предложен экспресс-метод оценки таргет-специфической цитолитической активности, индуцированной экспрессией CAR в клетках Jurkat. Все конструкции CAR имеют один и тот же scFv, но разные шарнирные и трансмембранные домены, которые, как было показано, влияют на активность CAR-T-клеток13...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

MDA-MB-231 были любезным подарком от доктора Шейна Стеклайна. Авторы выражают признательность за финансирование со стороны Онкологического центра Университета Канзаса для проведения этого исследования.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Tube (Sterile)Midwest Scientific#C15BAny similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)Thermo Scientific339652Any similar will work
Black/Clear 96 well plateFalcon353219Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CAny similar will work
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersion 5.3.0.0Any similar will work
Cell Culture IncubatorThermo ScientificHeraCell 160iAny similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)TPP90076Any similar will work
CFSETonbo13-0850-U500Any similar will work
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Any similar will work
DMEMGibco11995-040Any similar will work
FBSGemini bio-products900-108Any similar will work
Flow CytometerCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcAny similar will work
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Company Version 10.7.1Any similar will work
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Any similar will work
GraphPad SoftwareGraphPadVersion 9.3.1 (471)Any similar will work
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
PBSGibco10010-031Any similar will work
PenStrepGibco15070-063Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)Pr1maPR-1250RK-FL, etcAny similar will work
Pipettors Thermo ScientificFinnpipette F2Any similar will work
Propidium IodideInvitrogenP1304MPAny similar will work
RPMICorning10-041-cvAny similar will work
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)Pr1maPR-SERO-25, etcAny similar will work
Sodium PyruvateCorning25-000-CIAny similar will work
Sterile ReservoirsMidwest ScientificRESE-2000Any similar will work
Table top centrifugeEppendorf5810RAny similar will work

Ссылки

  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
  4. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
  5. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  6. Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
  7. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
  8. Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
  9. Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
  10. Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
  11. Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
  12. Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
  13. Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
  14. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  15. Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
  16. Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
  17. Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
  18. Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
  19. Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
  20. . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
  21. Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitroCARCARCARCAR TCARJurkatCARPBMC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены