JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.

Abstract

إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين - أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.

Introduction

يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية 1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى 3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ، والتي يمكنها إذابة الجلطات مباشرة ولكن يتم تعطيلها بسرعة بواسطة مثبطات البلازمين المختلفة5. بعد ذلك ، تم الإبلاغ عن نوع جديد من عوامل تحلل الفيبرين يمكنه إذابة الجلطة ليس فقط عن طريق تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين ولكن أيضا عن تدهور الفيبرين مباشرة 6-إنزيم تحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني القديمة Sipunculus nudus (sFE)6. تمنح هذه الوظيفة الثنائية مزايا أخرى على أدوية التخثر التقليدية ، خاصة من حيث حالة البلازمينوجين غير الطبيعية. بالمقارنة مع عوامل تحلل الفيبرين ثنائية الوظيفةالأخرى 7،8،9 ، يعرض sFE العديد من المزايا ، بما في ذلك السلامة ، على العوامل غير المشتقة من الأغذية لتطوير الأدوية ، وخاصة بالنسبة للأدوية الفموية. وذلك لأن السلامة البيولوجية والتوافق الحيوي ل Sipunculus nudus كانت راسخة10.

على غرار العوامل الطبيعية الأخرى المحللة للفبرين المعزولة من الكائنات الحية الدقيقة وديدان الأرض والفطر ، فإن تنقية sFE من S. nudus معقدة للغاية وتتضمن مراحل متعددة ، مثل تجانس الأنسجة ، وترسيب كبريتات الأمونيوم ، وتحلية المياه ، وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون ، وكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء ، والغربلة الجزيئية10،11،12. لا يعتمد نظام التنقية هذا على المهارات المتقنة والمواد باهظة الثمن فحسب ، بل يتطلب أيضا عدة أيام لإكمال الإجراء بأكمله. لذلك ، فإن برنامج تنقية بسيط من sFE له أهمية كبيرة لمزيد من التطوير ل sFE. لحسن الحظ ، بلورتان من sFE (PDB: 8HZP ؛ PDB: 8HZO) بنجاح (انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). من خلال التحليل الهيكلي وتجارب الالتحام الجزيئي ، وجدنا أن النواة التحفيزية ل sFE يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالأهداف التي تحتوي على بقايا الأرجينين أو اللايسين.

هنا ، تم اقتراح نظام تنقية التقارب لأول مرة ، بناء على البنية البلورية ل sFE. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تنقية sFE عالي النقاء والنشط للغاية من المستخلصات الخام في مرحلة تنقية تقارب واحدة. البروتوكول الذي تم تطويره هنا ليس مهما فقط لإعداد sFE على نطاق واسع ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لتنقية عوامل تحلل الفيبرين الأخرى.

Protocol

1. التحضير

  1. علاج العينة
    1. تشريح بعناية S. nudus الطازجة (100 غرام) وجمع الأمعاء والسوائل الداخلية.
    2. أضف 300 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، درجة الحموضة 7.4) للتجانس (1000 دورة في الدقيقة ، 60 ثانية).
    3. تجميد ذوبان الجليد المجانس 3x.
    4. أجهزة الطرد المركزي العينة (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) وجمع المادة الطافية. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  2. ترسيب البروتين
    1. امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ومتابعته لاحقا.
    2. أجهزة الطرد المركزي (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) للحصول على راسب البروتين ؛ قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.
  3. إعادة تعليق البروتين
    1. أعد تعليق راسب البروتين ب 30 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بتخزين محلول البروتين الخام هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.

2. كروماتوغرافيا التقارب

  1. ترشيح الحل
    1. قم بتصفية محلول البروتين الخام من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. احفظ هذه العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. تعبئة العمود
    1. قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة أرجينين - أغاروز وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز عن طريق تحميل كمية مناسبة من وسط مصفوفة ليسين - أغاروز ووسط مصفوفة أرجينين - أغاروز في أعمدة كروماتوغرافيا فارغة سعة 5 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين العمود عند 2-8 درجة مئوية ، مع غمر المصفوفة في مخزن مؤقت (20٪ إيثانول).
  3. تنقية التقارب
    1. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا التقارب مع ddH2O أولا (1 مل / دقيقة ، 10 أحجام أعمدة) ، متبوعا بالمخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، pH 8.0 ، 1 مل / دقيقة ، 5 أحجام أعمدة).
    2. قم بتحميل عينة محلول البروتين على العمود المتوازن مسبقا (1 مل / دقيقة ، حجم 1/3 عمود).
      ملاحظة: يعتمد حجم تحميل العينة على تركيز sFE.
    3. اغسل العمود باستخدام المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، خمسة أحجام أعمدة).
    4. قم بتحريك العمود ب 0.15 M و 0.25 M و 0.35 M و 0.45 M و 0.55 M و 0.65 M NaCl (1 مل / دقيقة ، خمسة أحجام أعمدة) على التوالي.
    5. ابحث عن قمة الشطف التي يجب أن تظهر في شطف كلوريد الصوديوم 0.15 M ، ثم اجمع الكسور في أنابيب 5 mL.
    6. ركز عينة الشطف باستخدام مرشح طرد مركزي فائق 3 كيلو دالتون (3944 × جم ، 1.5 ساعة ، 4 درجات مئوية). قم بتخزين هذه العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. تقييم النقاء

  1. الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) إعداد هلام
    1. تحضير جل SDS-PAGE وفقا لطريقة ليملي باستخدام جل مركز 5٪ وجل فصل 12٪13.
  2. الكهربائي
    1. امزج العينة (15 ميكرولتر) مع مخزن مؤقت لتحميل البروتين SDS-PAGE 5x (حجم 1/4) ، وقم بتسخينه في الماء المغلي لمدة 5 دقائق ، وقم بتحميله على جل SDS-PAGE ، وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت ، 60 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة.
  3. تحليل
    1. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتلطيخ الجل باستخدام Silver Stain Kit ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، ولاحظ الجل الملون باستخدام نظام تصوير كيميائي.
    2. تحليل نقاء البروتين المستهدف باستخدام الصيغة التالية: نقاء البروتين المستهدف = قيمة كثافة البروتين المستهدف / قيمة كثافة البروتين الكلي.

4. تقييم نشاط تحلل الفيبرين

  1. إعداد لوحة الفيبرين
    1. تحضير محلول الفيبرينوجين عن طريق خلط 25 ملغ من الفيبرينوجين مع 1.25 مل من المياه المالحة الفسيولوجية.
    2. تحضير محلول الثرومبين عن طريق خلط 100 وحدة من الثرومبين تماما مع 1.05 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي.
    3. تحضير محلول الأغاروز بإضافة 0.5 غرام من الأغاروز إلى 22.5 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 مول / لتر ، درجة الحموضة 7.4). اخلطي محلول الأغاروز وسخنيه على حرارة 100 درجة مئوية حتى يذوب تماما.
    4. قم بتبريد محلول الأغاروز إلى حوالي 50 درجة مئوية وأضف محلول الفيبرينوجين. ثم ، أضف محلول الثرومبين على الفور ، واخلطه بسرعة ، واسكبه في طبق استزراع 60 مم.
  2. تحميل
    1. لكمة الآبار 3 مم على ألواح الفيبرين المعدة باستخدام حفار معقم وملء الآبار بعينات 10 ميكرولتر.
  3. تحليل
    1. بعد 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بقياس نشاط تحلل الفيبرين عن طريق حساب حجم مناطقها المتحللة. نشاط تحلل الفيبرين = (حجم منطقة العينة / حجم منطقة يوروكيناز) × 100 وحدة حجم المنطقة = القطر × القطر.
      ملاحظة: تم استخدام المخزن الملحي الفسيولوجي والبروتين الخام (تم الحصول على العينة في خطوة البروتوكول 1.3.1) و urokinase للتحكم السلبي والتحكم الإيجابي ، على التوالي. بالمقارنة مع urokinase ، وجدنا أن النشاط التحلل للفبرين من sFE المنقى كان ~ 19200 وحدة / مل.

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج محللات الأنسجة الخام ، وتم بناء مصفوفة أرجينين-أغاروز وأعمدة كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين-أغاروز ، وتم الحصول على sFE المنقى ، وتم قياس النقاء والنشاط التحلل للفبرين ل sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE وألواح الفيبرين ، على التوالي.

بعد الطرد المر?...

Discussion

نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus14 الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، و...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)Biosharp
2-MercaptoethanolSolarbio
Agarose G-10Biowest
Ammonium persulfateSINOPHARM
Ammonium sulfateSINOPHARM
Arginine-Sepharose 4BSolarbioArginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)Solarbio
Fast Silver Stain KitBeyotime
FibrinogenMerck
GlycineSolarbio
Hydrochloric acidSINOPHARM
KinaseRHAWN
Lysine-Sepharose 4BSolarbioLysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)Beyotime
Sodium chlorideSINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)Sigma-Aldrich
Sodium hydroxideSINOPHARM
ThrombinMeilunbio
Tris(Hydroxymethyl) AminomethaneSolarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane HydrochlorideSolarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pureGE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750SANYO
Chemiluminescence Imaging SystemGE
Constant Flow Pump BT-100QITE
Constant Temperature IncubatorJINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KSSIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140ADSENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-IISCIENTZ
Electronic Analytical BalanceDENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12SENXIN
Horizontal Decolorization ShakerKylin-Bell
Ice Machine AF 103Scotsman
KQ-500E Ultrasonic CleanerShuMei
Magnetic StirrerZhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-WCence
Microwave OvenGalanz
Milli-Q ReferenceMillipore
PipettorThermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH MeterSartorious
Small-sized Vortex OscillatorKylin-Bell
Vertical Electrophoresis SystemBio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL)Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)NEST
Centrifuge Tube (7 mL)Biosharp
Culture Dish (60 mm)NEST
Filter Membrane (0.22 µm)Millex GP
ParafilmBemis
Pipette Tip (1 mL )KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)Axygene
Pipette Tip (200 µL)Axygene
Special Indicator PaperTZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)Millipore
Universal pH IndicatorSSS Reagent

References

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
  11. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved