تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

Summary

هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.

Abstract

إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين - أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.

Introduction

يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية ^1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى ^3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ،....

Protocol

1. التحضير

1. علاج العينة
   1. تشريح بعناية S. nudus الطازجة (100 غرام) وجمع الأمعاء والسوائل الداخلية.
   2. أضف 300 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، درجة الحموضة 7.4) للتجانس (1000 دورة في الدقيقة ، 60 ثانية).
   3. تجميد ذوبان الجليد المجانس 3x.
   4. أجهزة الطرد المركزي العينة (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) وجمع المادة الطافية. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
2. ترسيب البروتين
   1. امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا....

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج محللات الأنسجة الخام ، وتم بناء مصفوفة أرجينين-أغاروز وأعمدة كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين-أغاروز ، وتم الحصول على sFE المنقى ، وتم قياس النقاء والنشاط التحلل للفبرين ل sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE وألواح الفيبرين ، على التوالي.

بعد الطرد المر?.......

Discussion

نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus¹⁴ الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، و.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent