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요약

여기에서는 간단하고 저렴하며 효율적인 Sipunculus nudus 의 섬유소 용해 효소의 친화성 정제 방법을 제시합니다.

초록

Sipunculus nudus(sFE)의 섬유소 용해 효소는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하고 피브린을 직접 분해할 수 있는 새로운 혈전용해제로 기존 혈전용해제에 비해 큰 이점을 보여줍니다. 그러나 구조 정보가 부족하기 때문에 sFE의 모든 정제 프로그램은 너무 복잡하고 비용이 많이 드는 다단계 크로마토그래피 정제를 기반으로 합니다. 여기서, sFE의 친화성 정제 프로토콜은 sFE의 결정 구조를 기반으로 최초로 개발되었습니다. 여기에는 미정제 시료 및 라이신/아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비, 친화성 정제 및 정제된 sFE의 특성 분석이 포함됩니다. 이 프로토콜에 따라 sFE 배치를 1일 이내에 정제할 수 있습니다. 또한 정제된 sFE의 순도와 활성은 각각 92% 및 19,200U/mL로 증가합니다. 따라서 이것은 sFE 정제를 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 sFE 및 기타 유사한 제제의 추가 활용에 매우 중요합니다.

서문

혈전증은 특히 Covid-19 세계적 대유행 이후 공중 보건에 대한 주요 위협입니다 1,2. 임상적으로, 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 및 유로키나제(UK)와 같은 많은 플라스미노겐 활성제(PA)가 혈전용해제로서 널리 사용되어 왔다. PA는 환자의 플라스미노겐을 활성 플라스민으로 활성화하여 피브린을 분해할 수 있습니다. 따라서, 이들의 혈전용해 효율은 환자의 플라스미노겐 상태에 의해 크게 제한된다 3,4. 메탈로프로테이나제 플라스민(metalloproteinase plasmin) 및 세린 플라스민(serine plasmin)과 같은 섬유소용해제는 혈전을 직접 용해시킬 수 있지만 다양한 플라스민 억제제에 의해 빠르게 비활성화되는 플라스민과 같은 섬유소용해효소(FE)를 포함하는 또 다른 유형의 임상 혈전용해제이다5. 그 후, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킬 뿐만 아니라 고대 땅콩 벌레 Sipunculus nudus(sFE)6의 섬유소 용해 효소인 피브린을 직접 분해하여 혈전을 용해시킬 수 있는 새로운 유형의 섬유소 용해제가 보고되었습니다.6. 이 이중기능은 특히 비정상적인 플라스미노겐 상태 측면에서 전통적인 혈전용해제에 비해 sFE에 다른 이점을 부여합니다. 다른 이관능성 혈전용해제7,8,9와 비교하여, sFE는 약물 개발, 특히 경구 약물에 대한 비식품 유래 제제에 비해 안전성을 포함한 몇 가지 이점을 나타낸다. 이는 Sipunculus nudus의 생체 안전성과 생체 적합성이 잘 확립되어 있기 때문입니다10.

미생물, 지렁이 및 버섯으로부터 분리된 다른 천연 섬유소용해제와 유사하게, S. nudus로부터의 sFE의 정제는 매우 복잡하며, 조직 균질화, 황산암모늄 침전, 담수화, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 분자체10,11,12와 같은 여러 단계를 포함한다. 이러한 정화 시스템은 숙련 된 기술과 값 비싼 재료에 의존 할뿐만 아니라 전체 절차를 완료하는 데 며칠이 걸립니다. 따라서 sFE의 간단한 정화 프로그램은 sFE의 추가 개발에 매우 중요합니다. 다행히 sFE의 두 결정(PDB: 8HZP; PDB: 8HZO)를 성공적으로 획득했습니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조). 구조 분석 및 분자 도킹 실험을 통해 sFE의 촉매 코어가 아르기닌 또는 라이신 잔기를 포함하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있음을 발견했습니다.

여기서, sFE의 결정구조에 기초한 친화성 정제 시스템이 최초로 제안되었다. 이 프로토콜을 따르면, 단일 친화성 정제 단계에서 미정제 추출물로부터 고순도 및 고활성 sFE를 정제할 수 있습니다. 여기에서 개발된 프로토콜은 sFE의 대규모 제조에 중요할 뿐만 아니라 다른 혈전용해제의 정제에도 적용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비

  1. 시료 처리
    1. 신선한 S. nudus (100g)를 조심스럽게 해부하고 장과 그 내부 액체를 수집하십시오.
    2. 균질화(1,000rpm, 60초)를 위해 300mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)을 추가합니다.
    3. 균질액을 3x 동결-해동합니다.
    4. 시료를 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하고 상층액을 수집한다. 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 4°C에서 보관하십시오.
  2. 단백질 침전
    1. 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합하고 혼합물을 4°C에서 12시간 동안 방치한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.
    2. 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하여 단백질 침전물을 얻는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에 보관하십시오.
  3. 단백질 재현탁
    1. 단백질 침전물을 30mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)으로 재현탁합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 조단백질 용액을 4°C에서 보관하십시오.

2. 친화성 크로마토그래피

  1. 용액 여과
    1. 조단백질 용액을 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 4°C에서 보관하십시오.
  2. 컬럼 패킹
    1. 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 매트릭스 크로마토그래피 컬럼을 5 mL 빈 크로마토그래피 컬럼에 적정량의 라이신-아가로스 매트릭스 배지와 아르기닌-아가로스 매트릭스 배지를 로딩하여 압축한다.
      참고: 컬럼은 2-8°C에서 보관할 수 있으며 매트릭스는 저장 완충액(20% 에탄올)에 담글 수 있습니다.
  3. 친화성 정제
    1. 친화성 크로마토그래피 컬럼을 먼저 ddH2O(1mL/분, 10컬럼 부피)로 평형화한 다음 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 8.0, 1mL/분, 5컬럼 부피)으로 평형을 이룹니다.
    2. 단백질 용액 샘플을 사전 평형화된 컬럼(1mL/분, 1/3컬럼 부피)에 로드합니다.
      참고: 샘플 로딩의 부피는 sFE의 농도에 따라 다릅니다.
    3. 컬럼을 Tris-HCl 완충액(0.02 M, pH 8.0, 5컬럼 부피)으로 세척합니다.
    4. 0.15 M, 0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M 및 0.65 M NaCl(1 mL/min, 5 컬럼 부피)로 컬럼을 순차적으로 용리합니다.
    5. 0.15M NaCl 용출에 나타나야 하는 용출 피크를 찾은 다음 5mL 튜브에서 분획을 수집합니다.
    6. 용출 시료를 3 kD 초원심 필터(3,944 × g, 1.5 h, 4°C)를 사용하여 농축한다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.

3. 순도 평가

  1. 소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔 제조
    1. 5% 농축 겔 및 12% 분리 겔을 사용하여 Laemmli's 방법에 따라 SDS-PAGE 겔을 제조하였다13.
  2. 전기영동
    1. 샘플(15μL)을 5x SDS-PAGE 단백질 로딩 버퍼(1/4 부피)와 혼합하고, 끓는 물에서 5분 동안 가열하고, SDS-PAGE 젤에 로드하고, 80V, 60mA에서 1.5시간 동안 겔을 실행합니다.
  3. 분석
    1. 전기영동 후 제조사의 프로토콜에 따라 Silver Stain Kit로 겔을 염색하고 화학발광 이미징 시스템을 이용하여 염색된 겔을 관찰합니다.
    2. 다음 공식을 사용하여 표적 단백질의 순도를 분석합니다: 표적 단백질의 순도 = 표적 단백질의 강도 값/총 단백질의 강도 값.

4. 혈전용해 활성 평가

  1. 피브린 플레이트 준비
    1. 피브리노겐 25mg과 생리식염수 1.25mL를 혼합하여 피브리노겐 용액을 준비합니다.
    2. 트롬빈 100U와 생리식염수 1.05mL를 완전히 혼합하여 트롬빈 용액을 준비한다.
    3. 22.5mL의 Tris-HCl 완충액(0.02mol/L, pH 7.4)에 0.5g의 아가로스를 첨가하여 아가로스 용액을 준비합니다. 완전히 용해될 때까지 100°C에서 아가로스 용액을 혼합하고 가열한다.
    4. 아가로스 용액을 약 50°C로 냉각하고 피브리노겐 용액을 첨가한다. 그런 다음 즉시 트롬빈 용액을 넣고 빠르게 혼합한 다음 60mm 배양 접시에 붓습니다.
  2. 로드
    1. 멸균 천공을 사용하여 준비된 피브린 플레이트에 3mm 웰을 펀칭하고 웰에 10μL 샘플을 채웁니다.
  3. 분석
    1. 37°C에서 18시간 배양한 후, 이들의 분해 구역의 크기를 계산하여 혈전용해 활성을 측정한다. 섬유소 용해 활성 = (샘플의 구역 크기/유로키나아제의 구역 크기) x 100U. 구역 크기 = 직경 x 직경.
      참고: 생리 식염수 완충액, 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플) 및 유로키나아제를 각각 블랭크, 음성 대조군 및 양성 대조군에 사용했습니다. 유로키나아제와 비교하여 정제된 sFE의 섬유소 용해 활성이 ~19,200U/mL임을 발견했습니다.

결과

이 프로토콜에 따라, 조조직 용해물을 추출하고, 아르기닌-아가로스 매트릭스 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼을 구축하고, 정제된 sFE를 얻고, 정제된 sFE의 순도 및 섬유소 용해 활성을 각각 SDS-PAGE 및 피브린 플레이트에 의해 측정하였다.

원심분리 후, 수집된 상층액은 투명한 황갈색 점성 액체였다. 침전은 이 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)...

토론

sFE의 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없기 때문에, 현재 사용되는 sFE는 신선한 S. nudus14로부터 추출되었다. 더욱이, 문헌에 보고된 sFE의 정제 절차는 분자량, 등전점, 이온 강도 및 극성과 같은 sFE의 몇 가지 일반적인 특징을 기반으로 하기 때문에 복잡하고 비용이 많이 들었습니다15,16. 현재까지 sFE의 친화성 정제 프로토콜은 보...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 샤먼시 과학기술국(3502Z20227197)과 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070, No.2021Y0027)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)Biosharp
2-MercaptoethanolSolarbio
Agarose G-10Biowest
Ammonium persulfateSINOPHARM
Ammonium sulfateSINOPHARM
Arginine-Sepharose 4BSolarbioArginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)Solarbio
Fast Silver Stain KitBeyotime
FibrinogenMerck
GlycineSolarbio
Hydrochloric acidSINOPHARM
KinaseRHAWN
Lysine-Sepharose 4BSolarbioLysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)Beyotime
Sodium chlorideSINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)Sigma-Aldrich
Sodium hydroxideSINOPHARM
ThrombinMeilunbio
Tris(Hydroxymethyl) AminomethaneSolarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane HydrochlorideSolarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pureGE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750SANYO
Chemiluminescence Imaging SystemGE
Constant Flow Pump BT-100QITE
Constant Temperature IncubatorJINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KSSIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140ADSENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-IISCIENTZ
Electronic Analytical BalanceDENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12SENXIN
Horizontal Decolorization ShakerKylin-Bell
Ice Machine AF 103Scotsman
KQ-500E Ultrasonic CleanerShuMei
Magnetic StirrerZhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-WCence
Microwave OvenGalanz
Milli-Q ReferenceMillipore
PipettorThermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH MeterSartorious
Small-sized Vortex OscillatorKylin-Bell
Vertical Electrophoresis SystemBio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL)Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)NEST
Centrifuge Tube (7 mL)Biosharp
Culture Dish (60 mm)NEST
Filter Membrane (0.22 µm)Millex GP
ParafilmBemis
Pipette Tip (1 mL )KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)Axygene
Pipette Tip (200 µL)Axygene
Special Indicator PaperTZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)Millipore
Universal pH IndicatorSSS Reagent

참고문헌

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