Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

요약

여기에서는 간단하고 저렴하며 효율적인 Sipunculus nudus 의 섬유소 용해 효소의 친화성 정제 방법을 제시합니다.

초록

Sipunculus nudus(sFE)의 섬유소 용해 효소는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하고 피브린을 직접 분해할 수 있는 새로운 혈전용해제로 기존 혈전용해제에 비해 큰 이점을 보여줍니다. 그러나 구조 정보가 부족하기 때문에 sFE의 모든 정제 프로그램은 너무 복잡하고 비용이 많이 드는 다단계 크로마토그래피 정제를 기반으로 합니다. 여기서, sFE의 친화성 정제 프로토콜은 sFE의 결정 구조를 기반으로 최초로 개발되었습니다. 여기에는 미정제 시료 및 라이신/아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비, 친화성 정제 및 정제된 sFE의 특성 분석이 포함됩니다. 이 프로토콜에 따라 sFE 배치를 1일 이내에 정제할 수 있습니다. 또한 정제된 sFE의 순도와 활성은 각각 92% 및 19,200U/mL로 증가합니다. 따라서 이것은 sFE 정제를 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 sFE 및 기타 유사한 제제의 추가 활용에 매우 중요합니다.

서문

혈전증은 특히 Covid-19 세계적 대유행 이후 공중 보건에 대한 주요 위협입니다 ^1,2. 임상적으로, 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 및 유로키나제(UK)와 같은 많은 플라스미노겐 활성제(PA)가 혈전용해제로서 널리 사용되어 왔다. PA는 환자의 플라스미노겐을 활성 플라스민으로 활성화하여 피브린을 분해할 수 있습니다. 따라서, 이들의 혈전용해 효율은 환자의 플라스미노겐 상태에 의해 크게 제한된다 ^3,4. 메탈로프로테이나제 플라스민(metalloproteinase plasmin) 및 세린 플라스민(serine plasmin)과 같은 섬유소용해제는 혈전을 직접 용해시킬 수 있지만 다양한 플라스민 억제제에 의해 빠르게 비활성화되는 플라스민과 같은 섬유소용해효소(FE)를 포함하는 또 다른 유형의 임상 혈전용해제이다⁵. 그 후, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킬 뿐만 아니라 고대 땅콩 벌레 Sipunculus nudus(sFE)6의 섬유소 용해 효소인 피브린을 직접 분해하여 혈전을 ....

프로토콜

1. 준비

1. 시료 처리
   1. 신선한 S. nudus (100g)를 조심스럽게 해부하고 장과 그 내부 액체를 수집하십시오.
   2. 균질화(1,000rpm, 60초)를 위해 300mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)을 추가합니다.
   3. 균질액을 3x 동결-해동합니다.
   4. 시료를 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하고 상층액을 수집한다. 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 4°C에서 보관하십시오.
2. 단백질 침전
   1. 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합하고 혼합물을 4°C에서 12시간 동안 방치한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.
   2. 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하여 단백질 침전물을 얻는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에 보관하십시오.
3. 단백질 재현탁
   1. 단백질 침전물을 30mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)으로 재현탁합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 조단백질 용액을 4°C에서 보관하십시오.

토론

sFE의 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없기 때문에, 현재 사용되는 sFE는 신선한 S. nudus¹⁴로부터 추출되었다. 더욱이, 문헌에 보고된 sFE의 정제 절차는 분자량, 등전점, 이온 강도 및 극성과 같은 sFE의 몇 가지 일반적인 특징을 기반으로 하기 때문에 복잡하고 비용이 많이 들었습니다^15,16. 현재까지 sFE의 친화성 정제 프로토콜은 보.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent