シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

要約

ここでは、 Sipunculus nudus 由来の線溶酵素の簡便、安価、効率的なアフィニティー精製法を紹介します。

要約

Sipunculus nudusの線維素溶解酵素(sFE)は、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、フィブリンを直接分解することができる新しい線維素溶解剤であり、従来の血栓溶解剤よりも大きな利点を示します。ただし、構造情報が不足しているため、sFEのすべての精製プログラムは多段階クロマトグラフィー精製に基づいており、複雑でコストがかかりすぎます。ここでは、sFEの結晶構造に基づいてsFEのアフィニティー精製プロトコルが初めて開発されています。これには、粗サンプルとリジン/アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムの調製、アフィニティー精製、および精製されたsFEの特性評価が含まれます。このプロトコルに従って、sFEのバッチを1日以内に精製することができます。さらに、精製されたsFEの純度と活性はそれぞれ92%と19,200 U / mLに増加します。したがって、これはsFE精製のためのシンプルで安価で効率的なアプローチです。このプロトコルの開発は、sFEおよび他の同様のエージェントのさらなる利用にとって非常に重要です。

概要

血栓症は、特にCovid-19の世界的大流行に続いて、公衆衛生に対する大きな脅威です^1,2。臨床的には、組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)やウロキナーゼ(英国)などの多くのプラスミノーゲンアクチベーター(PA)が血栓溶解薬として広く使用されています。PAは、患者のプラスミノーゲンを活性プラスミンに活性化してフィブリンを分解することができます。したがって、それらの血栓溶解効率は、患者のプラスミノーゲン状態によって大きく制限されます^3,4。メタロプロテイナーゼプラスミンやセリンプラスミンなどの線溶剤は、プラスミンなどの線溶酵素(FE)も含む別のタイプの臨床血栓溶解薬であり、血栓を直接溶解できますが、さまざまなプラスミン阻害剤によって迅速に不活性化^{されます5。}その後、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化するだけでなく、古代ピーナッツワームSipunculus nudus(sFE^)の線溶酵素であるフィブリン6を直接分解することで血栓を溶解できる新しいタイプの線溶剤が報告されています^6。この二重機能は、特に異常なプラスミノーゲン状態に関して、従来の血栓溶解薬に比べてsFEに他の利点を与えます。他の二官能性線維素溶解剤^7,8,9と比較して、sFEは、医薬品開発、特に経口薬のための非食品由来薬剤に比べて、安全性を含むいくつかの利点を示します。これは、Sipunculus nudusのバイオセーフティと生体適合性が十分に確立されているためです¹⁰。

微生物、ミミズ、キノコから単離された他の天然線維素溶解剤と同様に、S. nudusからのsFEの精製は非常に複雑であり、組織の均質化、硫酸アンモニウム沈殿、脱塩、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子ふるい分けなどの複数の段階が含まれます^10,11,12.そのような精製システムは、熟練したスキルと高価な材料に依存するだけでなく、手順全体を完了するのに数日かかります。したがって、sFEの簡単な精製プログラムは、sFEのさらなる発展にとって非常に重要です。幸いなことに、sFEの2つの結晶(PDB:8HZP;PDB: 8HZO) が正常に取得されました (補足ファイル 1 および補足ファイル 2 を参照)。構造解析と分子ドッキング実験により、sFEの触媒コアがアルギニンまたはリジン残基を含むターゲットに特異的に結合できることを発見しました。

ここで、sFEの結晶構造に基づくアフィニティー精製システムが初めて提案されました。このプロトコルに従うことにより、高純度で高活性のsFEを単一のアフィニティー精製段階で粗抽出物から精製することができました。ここで開発されたプロトコルは、sFEの大規模な調製に重要であるだけでなく、他の線維素溶解剤の精製にも適用できます。

プロトコル

1. 事前準備

1. サンプル処理
   1. 新鮮な S. nudus (100 g)を慎重に解剖し、腸とその内液を集めます。
   2. ホモジナイズ(1,000 rpm、60 s)のために300 mLのトリス塩酸バッファー(0.02 M、pH 7.4)を加えます。
   3. ホモジネートを3倍凍結解凍します。
   4. サンプルを遠心分離(10,956 × g、0.5時間、4°C)し、上清を回収します。さらに使用するまでサンプルを4°Cで保存してください。
2. タンパク質沈殿
   1. 上清を飽和硫酸アンモニウム溶液(9倍量)と混合し、4°Cで12時間静置します。
      注: プロトコルはここで一時停止し、後で続行できます。
   2. 遠心分離機(10,956 × g、0.5時間、4°C)でタンパク質沈殿物を得る;後で使用するために4°Cで保管してください。
3. タンパク質再懸濁
   1. タンパク質沈殿物を30 mLのTris-HClバッファー(0.02 M、pH 7.4)で再懸濁します。この粗タンパク質溶液を後で使用するために4°Cで保存してください。

2. アフィニティークロマトグラフィー

1. 溶液ろ過
   1. 粗タンパク質溶液を0.22 μmのフィルターメンブレンでろ過します。後で使用するために、このサンプルを4°Cで保存してください。
2. カラムパッキング
   1. 適量のリジン-アガロースマトリックス培地とアルギニン-アガロースマトリックス培地を5 mLの空のクロマトグラフィーカラムにロードして、アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムとリジン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムを充填します。
      注:カラムは、マトリックスを保存バッファー(20%エタノール)に浸した状態で、2〜8°Cで保存できます。
3. アフィニティー精製
   1. アフィニティークロマトグラフィーカラムを最初にddH₂O(1 mL/min、10カラム容量)、続いてTris-HClバッファー(0.02 M、pH 8.0、1 mL/min、5カラム容量)で平衡化します。
   2. タンパク質溶液サンプルを事前に平衡化したカラム(1 mL/min、1/3カラム容量)にロードします。
      注:サンプル負荷量はsFEの濃度に依存します。
   3. トリス塩酸バッファー(0.02 M、pH 8.0、5カラム容量)でカラムを洗浄します。
   4. 0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M、および0.65 M NaCl(1 mL/min、5カラム容量)でカラムを連続して溶出します。
   5. 0.15 M NaCl 溶出に現れる溶出ピークを探し、5 mL チューブでフラクションを収集します。
   6. 3 kD超遠心フィルター(3,944 × g、1.5 h、4 °C)を使用して溶出サンプルを濃縮します。後で使用するために、このサンプルを-80°Cで保存してください。

3. 純度評価

1. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル調製
   1. 5%濃縮ゲルと12%分離ゲルを用いてレムリの方法に従ってSDS-PAGEゲルを調製する¹³。
2. 電気泳動
   1. サンプル(15 μL)を5x SDS-PAGEタンパク質ローディングバッファー(1/4容量)と混合し、沸騰水中で5分間加熱し、SDS-PAGEゲルにロードし、ゲルを80 V、60 mAで1.5時間分析します。
3. 解析
   1. 電気泳動後、メーカーのプロトコルに従ってシルバーステインキットでゲルを染色し、化学発光イメージングシステムを使用して染色されたゲルを観察します。
   2. 標的タンパク質の純度=標的タンパク質の強度値/全タンパク質の強度値を用いて、標的タンパク質の純度を解析します。

4. 線溶活性評価

1. フィブリンプレートの準備
   1. 25 mgのフィブリノーゲンを1.25 mLの生理食塩水と混合してフィブリノーゲン溶液を調製します。
   2. 100 Uのトロンビンを1.05 mLの生理食塩水と完全に混合してトロンビン溶液を調製します。
   3. 0.5 gのアガロースを22.5 mLのトリス塩酸緩衝液(0.02 mol/L、pH 7.4)に添加してアガロース溶液を調製します。アガロース溶液を混合し、完全に溶解するまで100°Cで加熱します。
   4. アガロース溶液を約50°Cまで冷却し、フィブリノーゲン溶液を加えます。次に、すぐにトロンビン溶液を加え、すばやく混合し、60 mmの培養皿に注ぎます。
2. 積載
   1. 滅菌ボーラーを使用して準備したフィブリンプレートに3 mmウェルを打ち込み、ウェルに10 μLのサンプルを充填します。
3. 解析
   1. 37°Cで18時間のインキュベーション後、それらの分解ゾーンのサイズを計算することにより、線溶活性を測定します。線溶活性=(サンプルのゾーンサイズ/ウロキナーゼのゾーンサイズ)x 100U。 ゾーンサイズ=直径x直径。
      注:生理食塩水緩衝液、粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル)、およびウロキナーゼを、それぞれブランク、ネガティブコントロール、およびポジティブコントロールに使用しました。ウロキナーゼと比較して、精製されたsFEの線溶活性は~19,200 U/mLであることがわかりました。

結果

このプロトコルに従って、粗組織ライセートを抽出し、アルギニン-アガロースマトリックスおよびリジン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムを構築し、精製sFEを取得し、精製sFEの純度および線溶活性をそれぞれSDS-PAGEおよびフィブリンプレートで測定した。

遠心分離後、回収した上清は透明な黄褐色の粘稠な液体であった。この上清を飽?...

ディスカッション

sFEの正確な遺伝子配列が利用できないため、現在使用されているsFEを新鮮なS.nudus14から抽出しました。さらに、文献で報告されているsFEの精製手順は、分子量、等電点、イオン強度、極性などのsFEの一般的な特徴に基づいているため、複雑で費用がかかりました^15,16。sFEのアフィニティー精製プロトコルはこれまでに報告さ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent