זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

Summary

כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.

Abstract

האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.

Introduction

פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית ^1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגן^{של החולים 3,4}. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות אך מושבתים במהירות על ידי מעכבי פלסמין שונים⁵. לאחר מכן, דווח על סוג חדש של סוכן פיברינוליטי שיכול להמיס את הפקקת לא רק על ידי הפעלת הפלזמינוגן לפלסמין, אלא גם פירוק הפיברין ישירות 6-האנזים הפיברינוליטי מתולעת הבוטנים העתיקה Sipunculus nudus (sFE)⁶. דו-תפקודי זה מעניק ל-sFE יתרונות נוספים על פני תרופות טרומבוליטיות מסורתיות, במיוחד במונחים של מצב פלסמינוגן חריג. בהשוואה לחומרים פיברינוליטיים דו-תפקודיים אחרים ^7,8,9, sFE מציג מספר יתרונות, כולל בטיחות, על פני חומרים שאינם נגזרים ממזון לפיתוח תרופות^, במיוחד עבור תרופות דרך הפה. הסיבה לכך היא שהבטיחות הביולוגית והתאימות הביולוגית של Sipunculus nudus התבססו היטב¹⁰.

בדומה לחומרים פיברינוליטיים טבעיים אחרים שבודדו ממיקרואורגניזמים, תולעי אדמה ופטריות, טיהור sFE מ-S. nudus הוא מסובך מאוד וכולל שלבים מרובים, כגון הומוגניזציה של רקמות, משקעים של אמוניום סולפט, התפלה, כרומטוגרפיה של חילופי אניון, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית וניפוי מולקולרי^10,11,12. מערכת טיהור כזו לא רק תלויה במיומנויות מיומנות וחומרים יקרים, אלא גם דורשת מספר ימים כדי להשלים את כל ההליך. לכן, תוכנית טיהור פשוטה של sFE היא בעלת משמעות רבה לפיתוח נוסף של sFE. למרבה המזל, שני גבישים של sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) הושגו בהצלחה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). באמצעות ניתוח מבני וניסויי עגינה מולקולרית, מצאנו כי הליבה הקטליטית של sFE יכולה להיקשר באופן ספציפי למטרות המכילות שאריות ארגינין או ליזין.

כאן הוצעה לראשונה מערכת טיהור זיקה, המבוססת על המבנה הגבישי של sFE. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לטהר sFE טהור מאוד ופעיל מאוד מהתמציות הגולמיות בשלב טיהור זיקה יחיד. הפרוטוקול שפותח כאן חשוב לא רק להכנת בקנה מידה גדול של sFE, אלא גם עשוי להיות מיושם לטיהור של סוכנים פיברינוליטיים אחרים.

Protocol

1. הכנה

1. טיפול לדוגמה
   1. בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.
   2. הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).
   3. להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.
   4. צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופרנטנט. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
2. משקעים חלבוניים
   1. מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולהמשיך אותו מאוחר יותר.
   2. צנטריפוגה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את משקע החלבון; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
3. תרחיף חלבונים
   1. להשהות מחדש את משקע החלבון עם 30 מ"ל של מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4). אחסנו את תמיסת החלבון הגולמי בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.

2. כרומטוגרפיית זיקה

1. סינון פתרונות
   1. סנן את תמיסת החלבון הגולמי דרך קרום מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן דגימה זו בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
2. אריזת עמודות
   1. ארוז את עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז ואת עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין-אגרוז על ידי טעינת כמות מתאימה של מדיום מטריצת ליזין-אגרוז ומדיום מטריצת ארגינין-אגרוז לעמודות כרומטוגרפיה ריקות של 5 מ"ל.
      הערה: ניתן לאחסן את העמודה בטמפרטורה של 2-8°C, כאשר המטריצה שקועה במאגר האחסון (20% אתנול).
3. טיהור אהדה
   1. אזן את עמודת כרומטוגרפיית הזיקה עם ddH₂O תחילה (1 מ"ל/דקה, 10 כרכים של עמודות), ואחריו מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, 1 מ"ל/דקה, 5 אמצעי אחסון).
   2. טען את דגימת תמיסת החלבון על העמודה המאוזנת מראש (1 מ"ל/דקה, נפח של 1/3 עמודה).
      הערה: נפח טעינת הדגימה תלוי בריכוז sFE.
   3. שטוף את העמודה באמצעות מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, חמישה כרכי עמודות).
   4. הצביעו על העמוד ברצף באורך 0.15 מ', 0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' NaCl (1 מ"ל/דקה, חמישה כרכי עמודות).
   5. חפש את שיא האלוציה שאמור להופיע ב- 0.15 M NaCl elution, ולאחר מכן אסוף את השברים בצינורות 5 מ"ל.
   6. רכז את דגימת האלוציה באמצעות מסנן אולטרה צנטריפוגלי 3 kD (3,944 × גרם, 1.5 שעות, 4 ° C). אחסן דגימה זו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.

3. הערכת טוהר

1. נתרן דודציל-סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל הכנה
   1. הכינו את ג'ל SDS-PAGE לפי השיטה של Laemmli באמצעות 5% ג'ל מרוכז ו-12% ג'ל הפרדה¹³.
2. אלקטרופורזה
   1. ערבבו את הדגימה (15 מיקרוליטר) עם מאגר העמסת חלבון 5x SDS-PAGE (1/4 נפח), חממו במים רותחים למשך 5 דקות, טענו על ג'ל SDS-PAGE והפעילו את הג'ל במתח של 80 וולט, 60 מיליאמפר למשך שעה וחצי.
3. ניתוח
   1. לאחר אלקטרופורזה יש לצבוע את הג'ל בערכת כתמים כסופה, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ולצפות בג'ל המוכתם באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית.
   2. נתח את טוהר חלבון המטרה באמצעות הנוסחה הבאה: טוהר חלבון המטרה = ערך העוצמה של חלבון המטרה / ערך העוצמה של סך החלבון.

4. הערכת פעילות פיברינוליטית

1. הכנת צלחת פיברין
   1. הכן את הפתרון פיברינוגן על ידי ערבוב 25 מ"ג של פיברינוגן עם 1.25 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.
   2. הכן את פתרון תרומבין על ידי ערבוב מלא 100 U של תרומבין עם 1.05 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.
   3. הכן את תמיסת האגרוז על ידי הוספת 0.5 גרם אגרוז ל 22.5 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.4). מערבבים ומחממים את תמיסת האגרוז ב-100°C עד להמסה מלאה.
   4. מצננים את תמיסת האגרוז עד לסביבות 50°C ומוסיפים תמיסת פיברינוגן. לאחר מכן, מיד להוסיף את פתרון טרומבין, לערבב אותם במהירות, ויוצקים אותם לתוך צלחת תרבית 60 מ"מ.
2. טעינת
   1. ניקבו בארות 3 מ"מ על לוחות הפיברין המוכנים באמצעות בורר סטרילי ומלאו את הבארות בדגימות 10 μL.
3. ניתוח
   1. לאחר 18 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, למדוד את הפעילות הפיברינוליטית על ידי חישוב גודל האזורים השפלה שלהם. פעילות פיברינוליטית = (גודל אזור הדגימה / גודל אזור האורוקינאז) x 100 U. גודל אזור = קוטר x קוטר.
      הערה: חיץ מלח פיזיולוגי, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בשלב פרוטוקול 1.3.1) ואורוקינאז שימשו לבקרה הריקה, השלילית והחיובית, בהתאמה. בהשוואה לאורוקינאז, מצאנו כי הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהר הייתה ~ 19,200 U/mL.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.

לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. ה...

Discussion

בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus¹⁴ טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות^15,16

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent