Аффинная очистка фибринолитического фермента из Sipunculus nudus

Резюме

Здесь мы представляем метод аффинной очистки фибринолитического фермента из Sipunculus nudus , который является простым, недорогим и эффективным.

Аннотация

Фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE) является новым фибринолитическим агентом, который может как активировать плазминоген в плазмин, так и напрямую расщеплять фибрин, демонстрируя большие преимущества по сравнению с традиционными тромболитическими агентами. Однако из-за недостатка структурной информации все программы очистки sFE основаны на многоступенчатых хроматографических очистках, которые являются слишком сложными и дорогостоящими. Здесь впервые разработан протокол аффинной очистки sFE на основе кристаллической структуры sFE; он включает в себя подготовку сырого образца и колонки аффинной хроматографии лизина/аргинин-агарозной матрицы, аффинную очистку и характеристику очищенного sFE. Следуя этому протоколу, партия sFE может быть очищена в течение 1 дня. Кроме того, чистота и активность очищенного sFE увеличивается до 92% и 19 200 Ед/мл соответственно. Таким образом, это простой, недорогой и эффективный подход к очистке sFE. Разработка этого протокола имеет большое значение для дальнейшего использования sFE и других подобных агентов.

Введение

Тромбоз представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения, особенно после глобальной пандемии Covid-19 ^1,2. Клинически многие активаторы плазминогена (ПА), такие как активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и урокиназа (Великобритания), широко используются в качестве тромболитических препаратов. ПА могут активировать плазминоген пациентов в активный плазмин для расщепления фибрина. Таким образом, их тромболитическая эффективность сильно ограничена плазминогенным статусом пациентов ^3,4. Фибринолитические агенты, такие как металлопротеиназная плазмина и сериновый плазмин, являются еще одним типом клинических тромболитических препаратов, которые также включают фибринолитические ферменты (ФЭ), такие как плазмин, которые могут растворять сгустки напрямую, но быстро инактивируются различными ингибиторами плазмина⁵. Впоследствии сообщалось о новом типе фибринолитического агента, который может растворять тромб, не только активируя плазминоген в плазмин, но и разлагая непосредственно фибрин 6-фибринолитический фермент древнего арахисового червя Sipunculus nudus (sFE)⁶. Эта бифункция наделяет sFE другими преимуществами по сравнению с традиционными тромболитическими препаратами, особенно с точки зрения аномального статуса плазминогена. По сравнению с другими бифункциональными фибринолитическими агентами ^7,8,9, sFE демонстрирует ряд преимуществ, включая безопасность, по сравнению с непищевыми агентами для разработки лекарств, особенно для пероральных препаратов. Это связано с тем, что биобезопасность и биосовместимость Sipunculus nudus хорошо известны¹⁰.

Подобно другим природным фибринолитическим агентам, выделенным из микроорганизмов, дождевых червей и грибов, очистка sFE от S. nudus очень сложна и включает в себя несколько этапов, таких как гомогенизация тканей, осаждение сульфата аммония, опреснение, анионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и молекулярное просеивание^10,11,12. Такая система очистки не только зависит от профессиональных навыков и дорогостоящих материалов, но и требует нескольких дней для завершения всей процедуры. Поэтому простая программа очистки sFE имеет большое значение для дальнейшего развития sFE. К счастью, два кристалла sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) были успешно получены (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Благодаря структурному анализу и экспериментам по молекулярному стыковочному соединению мы обнаружили, что каталитическое ядро sFE может специфически связываться с мишенями, содержащими остатки аргинина или лизина.

Здесь впервые предложена система аффинной очистки, основанная на кристаллической структуре sFE. Следуя этому протоколу, высокочистый и высокоактивный sFE может быть очищен от сырых экстрактов на одной стадии аффинной очистки. Разработанный здесь протокол важен не только для крупномасштабного приготовления sFE, но также может быть применен для очистки других фибринолитических агентов.

протокол

1. Подготовка

1. Обработка образцов
   1. Тщательно препарируют свежий S. nudus (100 г) и собирают кишечник и его внутреннюю жидкость.
   2. Добавьте 300 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, pH 7,4) для гомогенизации (1000 об/мин, 60 с).
   3. Заморозьте-разморозьте гомогенат 3 раза.
   4. Центрифугируют пробу (10,956 × г, 0,5 ч, 4 °C) и собирают надосадочную жидкость. Храните образец при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
2. Осаждение белка
   1. Смешайте надосадочную жидкость с насыщенным раствором сульфата аммония (девять объемов) и дайте смеси настояться 12 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть поставлен на паузу здесь и продолжен позже.
   2. Центрифуга (10,956 × г, 0,5 ч, 4 °С) для получения белкового осадка; хранить при температуре 4 °C для последующего использования.
3. Ресуспендирование белка
   1. Ресуспендируют белковый осадок с 30 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, рН 7,4). Храните этот раствор сырого протеина при температуре 4 °C для последующего использования.

2. Аффинная хроматография

1. Фильтрация раствора
   1. Отфильтруйте раствор сырого белка через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Храните этот образец при температуре 4 °C для последующего использования.
2. Упаковка колонн
   1. Упакуйте колонку аффинной хроматографии аргинин-агарозной матрицы и колонку аффинной хроматографии лизин-агарозной матрицы, загрузив соответствующее количество матричной среды лизин-агарозы и матричной среды аргинин-агарозы в пустые хроматографические колонки объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонку можно хранить при температуре 2-8 °C, при этом матрица погружена в буфер хранения (20% этанол).
3. Аффинное очищение
   1. Сначала уравновесьте колонку аффинной хроматографии ddH₂O (1 мл / мин, объем 10 колонок), а затем буфер Tris-HCl (0,02 М, pH 8,0, 1 мл / мин, 5 объемов колонки).
   2. Загрузите образец белкового раствора в предварительно уравновешенную колонку (1 мл/мин, объем 1/3 колонки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем загрузки пробы зависит от концентрации sFE.
   3. Промойте колонку буфером Tris-HCl (0,02 М, рН 8,0, пять объемов колонки).
   4. Последовательно нанесите на колонну 0,15 М, 0,25 М, 0,35 М, 0,45 М, 0,55 М и 0,65 М NaCl (1 мл/мин, пять объемов колонны).
   5. Найдите пик элюирования, который должен появиться в элюировании NaCl 0,15 М, а затем соберите фракции в пробирки объемом 5 мл.
   6. Концентратируют элюирующий образец с помощью ультрацентробежного фильтра 3 кДа (3,944 × г, 1,5 ч, 4 °C). Храните этот образец при температуре -80 °C для последующего использования.

3. Оценка чистоты

1. Приготовление геля для электрофореза полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)
   1. Приготовьте гель SDS-PAGE по методу Леммли, используя 5% концентрированный гель и 12% разделительный гель¹³.
2. Электрофорез
   1. Смешайте образец (15 мкл) с 5-кратным буфером загрузки белка SDS-PAGE (1/4 объема), нагрейте в кипящей воде в течение 5 мин, загрузите на гель SDS-PAGE и запустите гель при напряжении 80 В, 60 мА в течение 1,5 часа.
3. Анализ
   1. После электрофореза окрашивают гель с помощью набора Silver Stain Kit, согласно протоколу производителя, и наблюдают за окрашенным гелем с помощью хемилюминесцентной системы визуализации.
   2. Проанализируйте чистоту целевого белка по следующей формуле: чистота целевого белка = значение интенсивности целевого белка / значение интенсивности общего белка.

4. Оценка фибринолитической активности

1. Подготовка фибриновой пластины
   1. Приготовьте раствор фибриногена, смешав 25 мг фибриногена с 1,25 мл физиологического раствора.
   2. Приготовьте раствор тромбина, полностью смешав 100 ЕД тромбина с 1,05 мл физиологического раствора.
   3. Приготовьте раствор агарозы, добавив 0,5 г агарозы к 22,5 мл буфера Tris-HCl (0,02 моль/л, рН 7,4). Смешайте и нагрейте раствор агарозы при 100 °C до полного растворения.
   4. Охладите раствор агарозы примерно до 50 °C и добавьте раствор фибриногена. Затем сразу же добавьте раствор тромбина, быстро перемешайте и вылейте в культуральную чашку диаметром 60 мм.
2. Погрузка
   1. Пробить 3-миллиметровые лунки на подготовленных фибриновых пластинах с помощью стерильного бура и заполнить лунки образцами 10 мкл.
3. Анализ
   1. После 18 ч инкубации при 37 °C измерьте фибринолитическую активность, вычислив размер их зон разложения. Фибринолитическая активность = (размер зоны образца / размер зоны урокиназы) x 100 ед. Размер зоны = диаметр х диаметр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологический солевой буфер, сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1) и урокиназа использовались для холостого, отрицательного и положительного контроля соответственно. По сравнению с урокиназой мы обнаружили, что фибринолитическая активность очищенного sFE составляет ~ 19 200 Ед / мл.

Результаты

В соответствии с этим протоколом были извлечены лизаты сырой ткани, построены колонки хроматографии с аффинностью аргинин-агарозного матрикса и лизин-агарозного матричного матрикса, получен очищенный sFE, а чистота и фибринолитическая активность очищенного sFE были измерены с помощью SD...

Обсуждение

Из-за отсутствия точной последовательности генов sFE используемый в настоящее время sFE был извлечен из свежего S. nudus¹⁴. Кроме того, процедуры очистки sFE, описанные в литературе, были сложными и дорогостоящими, поскольку они основывались на некоторых общих характеристиках...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent