Purificazione per affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo di purificazione di affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus che è semplice, economico ed efficiente.

Abstract

L'enzima fibrinolitico di Sipunculus nudus (sFE) è un nuovo agente fibrinolitico che può sia attivare il plasminogeno in plasmina che degradare direttamente la fibrina, mostrando grandi vantaggi rispetto agli agenti trombolitici tradizionali. Tuttavia, a causa della mancanza di informazioni strutturali, tutti i programmi di purificazione per sFE si basano su purificazioni cromatografiche multifase, che sono troppo complicate e costose. Qui, un protocollo di purificazione di affinità di sFE viene sviluppato per la prima volta basato su una struttura cristallina di sFE; comprende la preparazione del campione grezzo e della colonna cromatografica di affinità della matrice lisina/arginina-agarosio, la purificazione dell'affinità e la caratterizzazione della sFE purificata. Seguendo questo protocollo, un lotto di sFE può essere purificato entro 1 giorno. Inoltre, la purezza e l'attività della sFE purificata aumentano rispettivamente al 92% e a 19.200 U/ml. Pertanto, questo è un approccio semplice, economico ed efficiente per la purificazione sFE. Lo sviluppo di questo protocollo è di grande importanza per l'ulteriore utilizzo di sFE e altri agenti simili.

Introduzione

La trombosi è una grave minaccia per la salute pubblica, soprattutto a seguito della pandemia globale di Covid-19 ^1,2. Clinicamente, molti attivatori del plasminogeno (PA), come l'attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) e l'urochinasi (Regno Unito), sono stati ampiamente utilizzati come farmaci trombolitici. Le PA possono attivare il plasminogeno dei pazienti in plasmina attiva per degradare la fibrina. Pertanto, la loro efficienza trombolitica è fortemente limitata dallo stato del plasminogeno dei pazienti ^3,4. Gli agenti fibrinolitici, come la plasmina metalloproteinasi e la plasmina serina, sono un altro tipo di farmaco trombolitico clinico che include anche enzimi fibrinolitici (FE) come la plasmina, che possono sciogliere direttamente i coaguli ma sono rapidamente inattivati da vari inibitori della plasmina⁵. Successivamente, è stato riportato un nuovo tipo di agente fibrinolitico che può dissolvere il trombo non solo attivando il plasminogeno in plasmina, ma anche degradando direttamente la fibrina 6-l'enzima fibrinolitico dall'antico verme delle arachidi Sipunculus nudus (sFE)⁶. Questa bifunzione conferisce a sFE altri vantaggi rispetto ai farmaci trombolitici tradizionali, specialmente in termini di stato anomalo del plasminogeno. Rispetto ad altri agenti fibrinolitici bifunzionali ^7,8,9, sFE mostra diversi vantaggi, tra cui la sicurezza, rispetto agli agenti derivati non alimentari per lo sviluppo di farmaci, in particolare per i farmaci orali. Questo perché la biosicurezza e la biocompatibilità di Sipunculus nudus sono state ben stabilite¹⁰.

Analogamente agli altri agenti fibrinolitici naturali isolati da microrganismi, lombrichi e funghi, la purificazione di sFE da S. nudus è molto complicata e comprende più fasi, come l'omogeneizzazione dei tessuti, la precipitazione del solfato di ammonio, la desalinizzazione, la cromatografia a scambio anionico, la cromatografia di interazione idrofobica e la setacciatura molecolare^10,11,12. Un tale sistema di purificazione non dipende solo da competenze competenti e materiali costosi, ma richiede anche diversi giorni per completare l'intera procedura. Pertanto, un semplice programma di purificazione di sFE è di grande importanza per l'ulteriore sviluppo di sFE. Fortunatamente, due cristalli di sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) sono stati ottenuti con successo (vedere File supplementare 1 e File supplementare 2). Attraverso analisi strutturali ed esperimenti di docking molecolare, abbiamo scoperto che il nucleo catalitico di sFE potrebbe legarsi specificamente a bersagli contenenti residui di arginina o lisina.

Qui, è stato proposto per la prima volta un sistema di purificazione di affinità, basato sulla struttura cristallina di sFE. Seguendo questo protocollo, la sFE altamente pura e altamente attiva potrebbe essere purificata dagli estratti grezzi in un unico stadio di purificazione di affinità. Il protocollo sviluppato qui non è importante solo per la preparazione su larga scala di sFE, ma può anche essere applicato per la purificazione di altri agenti fibrinolitici.

Protocollo

1. Preparazione

1. Trattamento del campione
   1. Sezionare con cura S. nudus fresco (100 g) e raccogliere l'intestino e il suo fluido interno.
   2. Aggiungere 300 ml di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) per l'omogeneizzazione (1.000 rpm, 60 s).
   3. Congelare-scongelare l'omogenato 3x.
   4. Centrifugare il campione (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) e raccogliere il surnatante. Conservare il campione a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
2. Precipitazione proteica
   1. Mescolare il surnatante con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi) e lasciare riposare la miscela per 12 ore a 4 °C.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui e continuato in seguito.
   2. Centrifugare (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) per ottenere il precipitato proteico; conservare a 4 °C per un uso successivo.
3. Risospensione proteica
   1. Risospendere il precipitato proteico con 30 mL di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservare questa soluzione proteica grezza a 4 °C per un uso successivo.

2. Cromatografia di affinità

1. Filtrazione della soluzione
   1. Filtrare la soluzione proteica grezza attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Conservare questo campione a 4 °C per un uso successivo.
2. Impacchettamento della colonna
   1. Imballare la colonna cromatografica di affinità arginina-agarosio e la colonna cromatografica di affinità matrice lisina-agarosio caricando una quantità appropriata di terreno di matrice lisina-agarosio e di terreno di matrice di arginina-agarosio in colonne cromatografiche vuote da 5 ml.
      NOTA: La colonna può essere conservata a 2-8 °C, con la matrice immersa nel tampone di stoccaggio (20% di etanolo).
3. Purificazione per affinità
   1. Equilibrare la colonna cromatografica di affinità con ddH₂O prima (1 mL/min, 10 volumi di colonna), seguita da tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volumi di colonna).
   2. Caricare il campione della soluzione proteica sulla colonna preequilibrata (1 ml/min, 1/3 di volume della colonna).
      NOTA: Il volume di carico del campione dipende dalla concentrazione di sFE.
   3. Lavare la colonna con tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinque volumi di colonna).
   4. Eluire la colonna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M NaCl (1 mL/min, cinque volumi di colonna) successivamente.
   5. Cercare il picco di eluizione che dovrebbe apparire nell'eluizione di NaCl 0,15 M, quindi raccogliere le frazioni in tubi da 5 ml.
   6. Concentrare il campione di eluizione utilizzando un filtro ultracentrifugo da 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservare questo campione a -80 °C per un uso successivo.

3. Valutazione della purezza

1. Preparazione gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil-solfato poliacrilammide (SDS-PAGE)
   1. Preparare il gel SDS-PAGE secondo il metodo Laemml utilizzando gel concentrato al 5% e gel di separazione al 12%¹³.
2. Elettroforesi
   1. Mescolare il campione (15 μL) con 5 tampone di carico proteico SDS-PAGE (1/4 di volume), riscaldare in acqua bollente per 5 minuti, caricare sul gel SDS-PAGE e far funzionare il gel a 80 V, 60 mA per 1,5 ore.
3. Analisi
   1. Dopo l'elettroforesi, colorare il gel con un Silver Stain Kit, secondo il protocollo del produttore, e osservare il gel colorato utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza.
   2. Analizzare la purezza della proteina bersaglio utilizzando la seguente formula: purezza della proteina bersaglio = valore di intensità della proteina bersaglio/valore di intensità della proteina totale.

4. Valutazione dell'attività fibrinolitica

1. Preparazione della piastra di fibrina
   1. Preparare la soluzione di fibrinogeno mescolando 25 mg di fibrinogeno con 1,25 ml di soluzione fisiologica.
   2. Preparare la soluzione di trombina mescolando completamente 100 U di trombina con 1,05 ml di soluzione salina fisiologica.
   3. Preparare la soluzione di agarosio aggiungendo 0,5 g di agarosio a 22,5 ml di tampone Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mescolare e riscaldare la soluzione di agarosio a 100 °C fino a completa dissoluzione.
   4. Raffreddare la soluzione di agarosio fino a circa 50 °C e aggiungere la soluzione di fibrinogeno. Quindi, aggiungere immediatamente la soluzione di trombina, mescolarli rapidamente e versarli in un piatto di coltura da 60 mm.
2. Caricamento
   1. Perforare i pozzetti da 3 mm sulle piastre di fibrina preparate usando una piralide sterile e riempire i pozzetti con campioni da 10 μL.
3. Analisi
   1. Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C, misurare l'attività fibrinolitica calcolando la dimensione delle loro zone degradanti. Attività fibrinolitica = (dimensione della zona del campione/dimensione della zona dell'urochinasi) x 100 U. Dimensione della zona = diametro x diametro.
      NOTA: Tampone fisiologico salino, proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo) e urochinasi sono stati utilizzati rispettivamente per il controllo bianco, negativo e positivo. Rispetto all'urochinasi, abbiamo scoperto che l'attività fibrinolitica della sFE purificata era ~ 19.200 U / ml.

Risultati

Seguendo questo protocollo, sono stati estratti lisati di tessuto grezzo, sono state costruite colonne cromatografiche di affinità matrice arginina-agarosio e matrice lisina-agarosio, è stata ottenuta sFE purificata e la purezza e l'attività fibrinolitica della sFE purificata sono state misurate rispettivamente da SDS-PAGE e piastre di fibrina.

Dopo la centrifugazione, il surnatante raccolto era un liquido viscoso marrone chiaro. Le precipitazioni sono iniziate quando questo surnatante è s...

Discussione

A causa dell'indisponibilità dell'esatta sequenza genica di sFE, la sFE attualmente utilizzata è stata estratta da S. nudus¹⁴ fresco. Inoltre, le procedure di purificazione di sFE riportate in letteratura erano complicate e costose, in quanto basate su alcune caratteristiche generali di sFE, come il peso molecolare, il punto isoelettrico, la forza ionica e la polarità^15,16. Nessun protocollo di purificazione di affinità di sFE...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent