Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus

Resumen

Aquí, presentamos un método de purificación de afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que es simple, económico y eficiente.

Resumen

La enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) es un nuevo agente fibrinolítico que puede activar el plasminógeno en plasmina y degradar la fibrina directamente, mostrando grandes ventajas sobre los agentes trombolíticos tradicionales. Sin embargo, debido a la falta de información estructural, todos los programas de purificación para sFE se basan en purificaciones por cromatografía de varios pasos, que son demasiado complicadas y costosas. Aquí, se desarrolla por primera vez un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en una estructura cristalina de sFE; incluye la preparación de la muestra cruda y la columna de cromatografía de afinidad de la matriz lisina/arginina-agarosa, la purificación de afinidad y la caracterización del sFE purificado. Siguiendo este protocolo, un lote de sFE se puede purificar en 1 día. Además, la pureza y la actividad del sFE purificado aumentan a 92% y 19,200 U/mL, respectivamente. Por lo tanto, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de sFE. El desarrollo de este protocolo es de gran importancia para la utilización posterior de sFE y otros agentes similares.

Introducción

La trombosis es una amenaza importante para la salud pública, especialmente después de la pandemia mundial de Covid-19 ^1,2. Clínicamente, muchos activadores del plasminógeno (AP), como el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) y la uroquinasa (Reino Unido), se han utilizado ampliamente como fármacos trombolíticos. Los PA pueden activar el plasminógeno de los pacientes en plasmina activa para degradar la fibrina. Así, su eficiencia trombolítica está fuertemente restringida por el estado plasminógeno de los pacientes ^3,4. Los agentes fibrinolíticos, como la metaloproteinasa plasmina y la serina plasmina, son otro tipo de fármaco trombolítico clínico que también incluye enzimas fibrinolíticas (FE) como la plasmina, que pueden disolver los coágulos directamente, pero son rápidamente inactivados por varios inhibidores de la plasmina⁵. Posteriormente, se ha informado de un nuevo tipo de agente fibrinolítico que puede disolver el trombo no solo activando el plasminógeno en plasmina, sino también degradando la fibrina directamente 6-la enzima fibrinolítica del antiguo gusano del maní Sipunculus nudus (sFE)⁶. Esta bifunción otorga a sFE otras ventajas sobre los fármacos trombolíticos tradicionales, especialmente en términos de estado anormal del plasminógeno. En comparación con otros agentes fibrinolíticos bifuncionales ^7,8,9, la sFE muestra varias ventajas, incluida la seguridad, sobre los agentes no derivados de alimentos para el desarrollo de fármacos, especialmente para medicamentos orales. Esto se debe a que la bioseguridad y biocompatibilidad de Sipunculus nudus han sido bien establecidas¹⁰.

Al igual que los otros agentes fibrinolíticos naturales aislados de microorganismos, lombrices de tierra y hongos, la purificación de sFE de S. nudus es muy complicada e incluye múltiples etapas, como homogeneización tisular, precipitación de sulfato de amonio, desalinización, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y tamizado molecular^10,11,12. Tal sistema de purificación no solo depende de habilidades competentes y materiales costosos, sino que también requiere varios días para completar todo el procedimiento. Por lo tanto, un programa simple de purificación de sFE es de gran importancia para el desarrollo posterior de sFE. Afortunadamente, dos cristales de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) se han obtenido con éxito (ver Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2). A través del análisis estructural y los experimentos de acoplamiento molecular, encontramos que el núcleo catalítico de sFE podría unirse específicamente a objetivos que contienen residuos de arginina o lisina.

Aquí, se propuso por primera vez un sistema de purificación de afinidad, basado en la estructura cristalina de sFE. Siguiendo este protocolo, la sFE altamente pura y altamente activa podría purificarse a partir de los extractos crudos en una sola etapa de purificación de afinidad. El protocolo desarrollado aquí no solo es importante para la preparación a gran escala de sFE, sino que también se puede aplicar para la purificación de otros agentes fibrinolíticos.

Protocolo

1. Preparación

1. Tratamiento de la muestra
   1. Diseccionar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) y recoger el intestino y su líquido interno.
   2. Añadir 300 ml de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneización (1.000 rpm, 60 s).
   3. Congelar-descongelar el homogeneizado 3x.
   4. Centrifugar la muestra (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) y recoger el sobrenadante. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso posterior.
2. Precipitación de proteínas
   1. Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y continuar más tarde.
   2. Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtener el precipitado proteico; Almacénelo a 4 °C para su uso posterior.
3. Resuspensión proteica
   1. Resuspender el precipitado proteico con 30 mL de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solución de proteína cruda a 4 °C para su uso posterior.

2. Cromatografía de afinidad

1. Filtración de soluciones
   1. Filtrar la solución de proteína cruda a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta muestra a 4 °C para su uso posterior.
2. Embalaje de columnas
   1. Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml.
      NOTA: La columna se puede almacenar a 2-8 °C, con la matriz sumergida en tampón de almacenamiento (20% de etanol).
3. Purificación de afinidad
   1. Equilibrar la columna de cromatografía de afinidad con ddH₂O primero (1 mL/min, 10 volúmenes de columna), seguido de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volúmenes de columna).
   2. Cargue la muestra de solución de proteína en la columna preequilibrada (1 ml/min, volumen de 1/3 columna).
      NOTA: El volumen de carga de la muestra depende de la concentración de sFE.
   3. Lave la columna con tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, volúmenes de cinco columnas).
   4. Eluya la columna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl (1 ml/min, cinco volúmenes de columna) sucesivamente.
   5. Busque el pico de elución que debe aparecer en la elución de NaCl 0.15 M y luego recoja las fracciones en tubos de 5 ml.
   6. Concentrar la muestra de elución utilizando un filtro ultracentrífugo de 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta muestra a -80 °C para su uso posterior.

3. Evaluación de la pureza

1. Preparación en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE)
   1. Preparar el gel SDS-PAGE según el método de Laemmli utilizando gel concentrado al 5% y gel de separación al 12%¹³.
2. Electroforesis
   1. Mezclar la muestra (15 μL) con 5 tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (1/4 volumen), calentar en agua hirviendo durante 5 min, cargar en el gel SDS-PAGE y hacer correr el gel a 80 V, 60 mA durante 1,5 h.
3. Análisis
   1. Después de la electroforesis, tiñe el gel con un kit de tinción de plata, de acuerdo con el protocolo del fabricante, y observe el gel teñido utilizando un sistema de imágenes quimioluminiscentes.
   2. Analice la pureza de la proteína diana utilizando la siguiente fórmula: pureza de la proteína diana = valor de intensidad de la proteína diana/valor de intensidad de la proteína total.

4. Evaluación de la actividad fibrinolítica

1. Preparación de la placa de fibrina
   1. Preparar la solución de fibrinógeno mezclando 25 mg de fibrinógeno con 1,25 ml de solución salina fisiológica.
   2. Prepare la solución de trombina mezclando completamente 100 U de trombina con 1,05 ml de solución salina fisiológica.
   3. Preparar la solución de agarosa añadiendo 0,5 g de agarosa a 22,5 ml de tampón Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mezclar y calentar la solución de agarosa a 100 °C hasta que se disuelva completamente.
   4. Enfriar la solución de agarosa hasta unos 50 °C y añadir la solución de fibrinógeno. Luego, agregue inmediatamente la solución de trombina, mézclelos rápidamente y viértalos en una fuente de cultivo de 60 mm.
2. Carga
   1. Perforar pocillos de 3 mm en las placas de fibrina preparadas utilizando un barrenador estéril y llenar los pocillos con muestras de 10 μL.
3. Análisis
   1. Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro.
      NOTA: Para el control blanco, el control negativo y el control positivo se utilizaron tampón salino fisiológico, proteína cruda (muestra obtenida en el paso 1.3.1 del protocolo) y uroquinasa. En comparación con la uroquinasa, encontramos que la actividad fibrinolítica de la sFE purificada fue ~ 19,200 U / ml.

Resultados

Siguiendo este protocolo, se extrajeron lisados tisulares crudos, se construyeron columnas de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y matriz de lisina-agarosa, se obtuvo sFE purificado y se midió la pureza y actividad fibrinolítica del sFE purificado mediante placas SDS-PAGE y fibrina, respectivamente.

Después de la centrifugación, el sobrenadante recogido era un líquido viscoso de color canela transparente. La precipitación comenzó cuando este sobrenadante se mezcló...

Discusión

Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia génica exacta de sFE, la sFE utilizada actualmente se extrajo de S. nudus¹⁴ fresco. Además, los procedimientos de purificación de sFE descritos en la literatura fueron complicados y costosos, ya que se basaron en algunas características generales de sFE, como el peso molecular, el punto isoeléctrico, la fuerza iónica y la polaridad^15,16. Hasta la fecha no se ha informado de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent