الكشف عن فيروس SARS-CoV-2 عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة النسخ العكسي

Summary

نقدم هنا بروتوكولا كاملا لتوحيد وتنفيذ طريقة الكشف عن فيروس SARS-CoV-2 في العينات البشرية عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة النسخ العكسي (RT-LAMP). يمكن تكييف هذه الطريقة ، التي تتم في غضون 60 دقيقة ، مع أي مختبر أو نقطة رعاية بتكلفة منخفضة وباستخدام معدات غير مكلفة.

Abstract

أثر فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) بشكل كبير على صحة الإنسان. لا يزال يشكل تهديدا للمجتمع الحديث لأن الكثير من الناس يموتون نتيجة للعدوى. يتم تشخيص المرض باستخدام الاختبارات المصلية والجزيئية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي القياسي الذهبي (RT-PCR). الأخير له العديد من العيوب لأنه يتطلب بنية تحتية متخصصة ومعدات مكلفة وموظفين مدربين. هنا ، نقدم بروتوكولا يحدد الخطوات المطلوبة للكشف عن فيروس SARS-CoV-2 باستخدام التضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة النسخ العكسي (RT-LAMP) في العينات البشرية. يتضمن البروتوكول تعليمات لتصميم البادئات في السيليكو ، وإعداد الكواشف ، والتضخيم ، والتصور. بمجرد توحيدها ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة وتكييفها مع أي مختبر أو نقطة رعاية في غضون 60 دقيقة بتكلفة منخفضة وباستخدام معدات غير مكلفة. إنه قابل للتكيف للكشف عن مسببات الأمراض المختلفة. وبالتالي ، يمكن استخدامه في الميدان وفي المراكز الصحية لإجراء المراقبة الوبائية في الوقت المناسب.

Introduction

يسبب فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). أعلنت منظمة الصحة العالمية حالة طوارئ صحية عمومية تثير قلقا دوليا في 30 كانون الثاني/يناير 2020 وجائحة في 11 آذار/مارس 2020. أدى الوباء إلى أكثر من 760 مليون حالة و 6.87 مليون حالة وفاة حتى تاريخ كتابة هذا المقال¹.

وقد سلط تأثير هذا الفيروس الضوء على الحاجة إلى أدوات مراقبة أفضل وأكثر دقة وأسرع ومتاحة على نطاق أوسع لتحسين الكشف عن الأمراض المعدية ومكافحتها ^2,3. خلال الوباء ، استندت الاختبارات التشخيصية ل SARS-CoV-2 إلى اكتشاف الحمض النووي والأجسام المضا....

Protocol

تم توفير العينات المستخدمة من قبل المختبر السريري لمستشفى Fundación Valle del Lili الجامعي وتتوافق مع الحمض النووي الريبي المنقى من المرضى الذين ثبتت إصابتهم ب COVID-19 باستخدام تقنية RT-qPCR. قدم جميع المرضى موافقة مستنيرة للبحث ، وتمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا للدراسات البشرية من مستشفى جامعة Fundación Valle del Lili.

1. تصميم وإعداد التمهيدي RT-LAMP

ملاحظة: يمكن استخدام بادئات LAMP مع مجموعة متنوعة من الأنظمة الأساسية ، بما في ذلك New England BioLabs (NEB) LAMP و Primer Explorer و LAMP assay multianalysis (LAVA). ومع ذلك ، بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام أداة ....

النتائج

يبدأ تنفيذ البروتوكول بتصميم مجموعة البادئات لكل جين مستهدف باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه. في يونيو 2020، تم الحصول على 5000 جينوم SARS-CoV-2 من قاعدة بيانات NextStrain، مع تمثيل 10٪ للجينومات الكولومبية. تمت محاذاة هذه التسلسلات للحصول على تسلسل الإجماع الذي تم استخدامه في عملية تصميم التمهيدي.

Discussion

على الرغم من أن RT-LAMP يعتبر منهجية تكميلية لإجراء التشخيص الجزيئي ، إلا أنه يحتوي أيضا على بعض القيود والخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها عند توحيد البروتوكول وتنفيذه.

قام توحيد LAMP للكشف عن SARS-CoV-2 بتقييم المعلمات والمكونات التالية في المزيج الرئيسي: (أ) تركيز ودرجة حرارة محاذا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.