通过逆转录环介导的等温扩增检测 SARS-CoV-2 病毒

摘要

在这里，我们提供了一个完整的协议，用于标准化和实施通过逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP） 检测人类样本中 SARS-CoV-2 病毒的方法。这种方法在 60 分钟内完成，可以以低成本和廉价的设备适用于任何实验室或护理点。

摘要

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 病毒对人类健康产生了巨大影响。它仍然是对现代社会的威胁，因为许多人因感染而死亡。该疾病通过血清学和分子检测进行诊断，例如金标准实时聚合酶链反应 （RT-PCR）。后者有几个缺点，因为它需要专门的基础设施、昂贵的设备和训练有素的人员。在这里，我们提出了一种协议，概述了在人类样本中使用逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP） 检测 SARS-CoV-2 病毒所需的步骤。该方案包括 计算机模拟设计引物、制备试剂、扩增和可视化的说明。一旦标准化，这种方法可以在 60 分钟内以低成本和廉价的设备轻松实施并适应任何实验室或护理点。它适用于检测不同的病原体。因此，它有可能在现场和卫生中心使用，以开展及时的流行病学监测。

引言

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 导致 2019 冠状病毒病 （COVID-19）。世界卫生组织于 2020 年 1 月 30 日宣布为国际关注的突发公共卫生事件，并于 2020 年 3 月 11 日宣布为大流行。截至本文撰写之日，大流行已导致超过 7.6 亿例病例和 687 万人死亡¹.

这种病毒的影响凸显了需要更好、更准确、更快和更广泛可用的监测工具，以改善传染病的检测和控制^2,3。在大流行期间，SARS-CoV-2 诊断测试基于检测核酸、抗体和蛋白质，但核酸的 RT-PCR 检测是金标准⁴。然而，RT-PCR有一些局限性;它需要专门的设备、基础设施和接受过分子生物学培训的人员，将其应用限制在专业实验室。此外，它很耗时（4-6 小时），不包括将标本运送到实验室的时间，这可能需要第⁵ 天。这些制约因素妨碍了有效的样本处理和获取应急计划和流行病学管理所需的信息。

与RT-PCR相比，逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）具有多项优势，使其成为设计未来即时诊断检测（POCT）的有吸引力的策略，特别是在资源

研究方案

使用的样本由 Fundación Valle del Lili 大学医院的临床实验室提供，对应于 使用 RT-qPCR 技术检测出 COVID-19 阳性的患者的纯化 RNA。所有患者都为研究提供了知情同意书，该研究得到了 Fundación Valle del Lili 大学医院的人类研究生物伦理委员会的批准。

1. RT-LAMP底漆设计与制备

注：LAMP 引物可用于多种平台，包括 New England BioLabs （NEB） LAMP、Primer Explorer 和 LAMP assay versatile analysis （LAVA）。但是，对于此协议，使用了NEB LAMP工具。可以使用从 NextStrain 数据库¹⁰ 获得的 SARS-CoV-2 基因组进行引物设计。 表1 显示了该协议中使用的引物组。

1. LAMP的底漆设计
   1. 获取病毒基因组序列。
   2. 执行序列比对以获得共识序列。
   3. 导航到 NEB LAMP 引物设计工具平台¹¹，并按照快速指南中的说明进行操作。该工具产生与引物探索器 V5 相同的结果，但它的输出更加人性化。使用引物浏览器用户手册作为引物设计的指....

讨论

尽管RT-LAMP被认为是执行分子诊断的补充方法，但它也有一些局限性和关键步骤，在标准化和实施协议时必须考虑这些限制和关键步骤。

用于检测 SARS-CoV-2 的 LAMP 标准化评估了预混液中的以下参数和成分：（a） 引物的浓度和比对温度;（b） 酶的浓度;（c） 镁浓度;（d） 反应时间;（e） 含有BSA、DMSO、氯化胍等添加剂;（f） 引物的设计;（g） 添加着色剂;（h） 使用内部生产的反?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.