Detecção do vírus SARS-CoV-2 por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa

Resumo

Aqui, fornecemos um protocolo completo para padronizar e implementar o método de detecção do vírus SARS-CoV-2 em amostras humanas por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP). Este método, feito em 60 min, pode ser adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento a baixo custo e usando equipamentos baratos.

Resumo

O vírus coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) afetou drasticamente a saúde humana. Continua a ser uma ameaça para a sociedade moderna porque muitas pessoas morrem como resultado de uma infecção. A doença é diagnosticada por meio de testes sorológicos e moleculares, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real padrão-ouro (RT-PCR). Este último tem várias desvantagens porque requer infraestrutura especializada, equipamentos caros e pessoal treinado. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo as etapas necessárias para detectar o vírus SARS-CoV-2 usando amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) em amostras humanas. O protocolo inclui instruções para projetar primers in silico, preparar reagentes, amplificação e visualização. Uma vez padronizado, esse método pode ser facilmente implementado e adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento em 60 minutos a baixo custo e usando equipamentos baratos. É adaptável à detecção de diferentes patógenos. Assim, pode potencialmente ser usado no campo e nos centros de saúde para realizar vigilância epidemiológica oportuna.

Introdução

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) causa a doença do coronavírus 2019 (COVID-19). A Organização Mundial da Saúde declarou uma emergência de saúde pública de interesse internacional em 30 de janeiro de 2020 e uma pandemia em 11 de março de 2020. A pandemia resultou em mais de 760 milhões de casos e 6,87 milhões de mortes na data em que este artigo foi escrito¹.

O impacto desse vírus destacou a necessidade de ferramentas de vigilância melhores, mais precisas, mais rápidas e mais amplamente disponíveis para melhorar a detecção e o controle de doenças infecciosas

Protocolo

As amostras utilizadas foram fornecidas pelo laboratório clínico do Hospital Universitário Fundación Valle del Lili e corresponderam ao RNA purificado de pacientes que testaram positivo para COVID-19 usando a técnica de RT-qPCR. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a pesquisa, e este estudo foi aprovado pelo comitê de bioética para estudos em seres humanos do Hospital Universitário Fundación Valle del Lili.

1. Projeto e preparação do primer RT-LAMP

NOTA: Os primers LAMP podem ser usados com uma variedade de plataformas, incluindo LAMP da New England BioLabs....

Discussão

Embora o RT-LAMP seja considerado uma metodologia complementar para a realização de diagnósticos moleculares, ele também apresenta algumas limitações e etapas críticas que devem ser consideradas quando o protocolo é padronizado e implementado.

A padronização LAMP para a detecção de SARS-CoV-2 avaliou os seguintes parâmetros e componentes no master mix: (a) concentração e temperatura de alinhamento dos primers; b) Concentração das enzimas; c) Concentração de magnésio; d) Tem.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.