Détection du virus SARS-CoV-2 par amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse

Résumé

Nous fournissons ici un protocole complet pour normaliser et mettre en œuvre la méthode de détection du virus SARS-CoV-2 dans des échantillons humains par amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP). Cette méthode, réalisée en 60 min, pourrait être adaptée à n’importe quel laboratoire ou point de service à faible coût et à l’aide d’équipements peu coûteux.

Résumé

Le virus du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a eu un impact considérable sur la santé humaine. Il continue d’être une menace pour la société moderne car de nombreuses personnes meurent des suites de l’infection. La maladie est diagnostiquée à l’aide de tests sérologiques et moléculaires, tels que l’amplification en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR). Ce dernier présente plusieurs inconvénients car il nécessite une infrastructure spécialisée, un équipement coûteux et un personnel formé. Nous présentons ici un protocole décrivant les étapes nécessaires à la détection du virus SARS-CoV-2 à l’aide de l’amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP) dans des échantillons humains. Le protocole comprend des instructions pour la conception d’amorces in silico, la préparation des réactifs, l’amplification et la visualisation. Une fois standardisée, cette méthode peut être facilement mise en œuvre et adaptée à n’importe quel laboratoire ou point de service en 60 minutes à faible coût et en utilisant un équipement peu coûteux. Il est adaptable à la détection de différents agents pathogènes. Ainsi, il peut potentiellement être utilisé sur le terrain et dans les centres de santé pour effectuer une surveillance épidémiologique en temps opportun.

Introduction

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est à l’origine de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). L’Organisation mondiale de la santé a déclaré une urgence de santé publique de portée internationale le 30 janvier 2020 et une pandémie le 11 mars 2020. La pandémie a entraîné plus de 760 millions de cas et 6,87 millions de décès à la date de rédaction de cet article¹.

L’impact de ce virus a mis en évidence la nécessité de disposer d’outils de surveillance meilleurs, plus précis, plus rapides et plus largement disponibles pour améliorer la détection et le contrôle des....

Protocole

Les échantillons utilisés ont été fournis par le laboratoire clinique de l’hôpital universitaire Fundación Valle del Lili et correspondaient à l’ARN purifié de patients testés positifs au COVID-19 à l’aide de la technique RT-qPCR. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé pour la recherche, et cette étude a été approuvée par le comité de bioéthique des études humaines de l’hôpital universitaire Fundación Valle del Lili.

1. Conception et préparation de l’apprêt RT-LAMP

REMARQUE : Les amorces LAMP peuvent être utilisées avec une variété de plateformes, y compris New England BioLabs (NEB) L....

Discussion

Bien que le RT-LAMP soit considéré comme une méthodologie complémentaire pour effectuer des diagnostics moléculaires, il présente également certaines limites et étapes critiques qui doivent être prises en compte lors de la normalisation et de la mise en œuvre du protocole.

La normalisation LAMP pour la détection du SARS-CoV-2 a évalué les paramètres et composants suivants dans le mélange maître : (a) concentration et température d’alignement des amorces ; b) la concentration.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.