역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

요약

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

초록

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스는 인간의 건강에 큰 영향을 미쳤습니다. 많은 사람들이 감염으로 사망하기 때문에 현대 사회에 계속 위협이 되고 있습니다. 이 질병은 황금 표준 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)과 같은 혈청학적 및 분자 검사를 사용하여 진단됩니다. 마지막은 전문 인프라, 값비싼 장비 및 숙련된 인력이 필요하기 때문에 몇 가지 단점이 있습니다. 여기에서는 인간 샘플에서 RT-LAMP(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification)를 사용하여 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 데 필요한 단계를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 silico에서 프라이머를 설계하고, 시약을 준비하고, 증폭 및 시각화하기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 표준화되면 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 60분 이내에 모든 실험실 또는 현장 진료에 쉽게 구현하고 적용할 수 있습니다. 다양한 병원체를 감지하는 데 적응할 수 있습니다. 따라서 현장 및 보건소에서 적시에 역학 감시를 수행하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

서문

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19)를 유발합니다. 세계보건기구(WHO)는 2020년 1월 30일 국제적 공중보건 비상사태를, 2020년 3월 11일 팬데믹을 선포했습니다. 팬데믹으로 인해 이 기사가 작성된 시점을 기준으로 7억 6천만 명 이상의 확진자와 687만 명의 사망자가 발생했습니다¹.

이 바이러스의 영향은 전염병 탐지 및 통제를 개선하기 위해 더 우수하고, 더 정확하고, 더 빠르고, 더 널리 사용 가능한 감시 도구의 필요성을 강조했습니다 ^2,3. 팬데믹 기간 동안 SARS-CoV-2 진단 검사는 핵산, 항체 및 단백질 검출을 기반으로 했지만 핵산의 RT-PCR 검출이 황금 표준입니다⁴. 그러나 RT-PCR에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 분자 생물학 교육을 받은 특수 장비, 인프라 및 인력이 필요하므로 전문 실험실로 적용이 제한됩니다. 또한 표본을 실험실로 운반하는 데 걸리는 시간을 제외하고 시간이 많이 소요되며(4-6시간) 며칠이 걸릴 수 있습니다

프로토콜

사용된 샘플은 Fundación Valle del Lili University 병원의 임상 실험실에서 제공되었으며 RT-qPCR 기술을 사용하여 COVID-19 양성 반응을 보인 환자의 정제된 RNA와 일치했습니다. 모든 환자는 연구에 대한 사전 동의를 제공했으며, 이 연구는 Fundación Valle del Lili University 병원의 인간 연구를 위한 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. RT-LAMP 프라이머 설계 및 준비

참고: LAMP 프라이머는 NEB(New England BioLabs) LAMP, Primer Explorer 및 LAMP assay versatile analysis(LAVA)를 포함한 다양한 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜의 경우 NEB LAMP 도구가 사용되었습니다. 프라이머 설계는 NextStrain 데이터베이스¹⁰에서 얻은 SARS-CoV-2 게놈을 사용하여 수행할 수 있습니다. 표 1 은 이 프로토콜에 사용된 프라이머 세트를 보여줍니다.

1. LAMP용 프라이머 설계
   1. 바이러스 게놈 염기서열을 얻....

토론

RT-LAMP는 분자 진단을 수행하기 위한 보완적인 방법론으로 간주되지만, 프로토콜을 표준화하고 구현할 때 고려해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계도 있습니다.

SARS-CoV-2 검출을 위한 LAMP 표준화는 마스터 믹스에서 다음 매개변수와 구성 요소를 평가했습니다: (a) 프라이머의 농도 및 정렬 온도; (b) 효소의 농도; (c) 마그네슘 농도; (d) 반응 시간; (e) BSA, DMSO, 구아니디늄 클?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.