逆転写ループを介した等温増幅によるSARS-CoV-2ウイルスの検出

要約

ここでは、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)によりヒトサンプル中のSARS-CoV-2ウイルスを検出する方法を標準化し、実装するための完全なプロトコルを提供します。この方法は60分以内に完了し、低コストで安価な機器を使用して、あらゆる検査室やポイントオブケアに適応できます。

要約

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルスは、人間の健康に劇的な影響を与えています。感染によって多くの人が亡くなるため、現代社会にとって脅威であり続けています。この疾患は、ゴールドスタンダードのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)などの血清学的および分子学的検査を使用して診断されます。後者には、特殊なインフラストラクチャ、高価な機器、および訓練を受けた人員が必要になるため、いくつかの欠点があります。ここでは、ヒトサンプルの逆転写ループ媒介等温増幅法(RT-LAMP)を使用してSARS-CoV-2ウイルスを検出するために必要な手順を概説したプロトコルを示します。このプロトコールには、 プライマーin silicoの設計、試薬の調製、増幅、および可視化の指示が含まれています。標準化されると、この方法は簡単に実装でき、60分以内に低コストで安価な機器を使用して、あらゆるラボやポイントオブケアに適応させることができます。さまざまな病原体の検出に適応できます。したがって、現場や保健センターでタイムリーな疫学監視を実施するために使用できる可能性があります。

概要

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、コロナウイルス病2019(COVID-19)を引き起こします。世界保健機関(WHO)は、2020年1月30日に国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態を宣言し、2020年3月11日にパンデミックを宣言しました。パンデミックにより、この記事が書かれた時点で7億6,000万人以上の症例と687万人の死亡者が出ています¹。

このウイルスの影響により、感染症の検出と制御を改善するために、より優れた、より正確で、より速く、より広く利用可能な監視ツールの必要性が浮き彫りになりました^2,3。パンデミック時には、SARS-CoV-2の診断検査は核酸、抗体、タンパク質の検出が基本でしたが、核酸のRT-PCR検出はゴールドスタンダードです⁴。ただし、RT-PCRにはいくつかの制限があります。これには、分子生物学の訓練を受けた特殊な機器、インフラストラクチャ、および人員が必要であり、その適用は専門の研究所に限定されています。さらに、それは時間がかかり(4〜6時間)、標本を実験室に輸送する時間を含まない、^{これには5}日かかることがあります。これらの制約により、効率的なサンプル処理や、....

プロトコル

使用されたサンプルは、Fundación Valle del Lili大学病院の臨床検査室から提供され、RT-qPCR技術を使用してCOVID-19の検査で陽性となった患者の精製されたRNAに対応しました。すべての患者が研究にインフォームドコンセントを提供し、この研究は、Fundación Valle del Lili大学病院のヒト研究の生命倫理委員会によって承認されました。

1. RT-LAMPプライマーの設計と調製

注:LAMPプライマーは、New England BioLabs(NEB)LAMP、Primer Explorer、LAMPアッセイ多用途分析(LAVA)など、さまざまなプラットフォームで使用できます。ただし、このプロトコルでは、NEB LAMPツールが使用されました。プライマー設計は、NextStrain database¹⁰から取得した SARS-CoV-2 ゲノムを使用して行うことができます。 表1 に、このプロトコールで使用されるプライマーセットを示します。

1. LAMPのプライマー設計
   1. ウイルスのゲノム配列を取得します。
   2. 配列アラインメントを実行して、コンセンサス配列を取得します。
   3. NEB LAMPプライマー....

ディスカッション

RT-LAMPは、分子診断を実行するための補完的な方法論と見なされていますが、プロトコルを標準化して実装する際に考慮しなければならないいくつかの制限と重要なステップもあります。

SARS-CoV-2の検出のためのLAMP標準化では、マスターミックスの次のパラメーターと成分が評価されました:(a)プライマーのアライメントの濃度と温度。(b)酵素の濃度。(c)マグネシウム濃度?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.