איתור נגיף SARS-CoV-2 על ידי הגברה איזותרמית בתיווך לולאת שעתוק לאחור

Summary

כאן אנו מספקים פרוטוקול מלא לסטנדרטיזציה ויישום השיטה לזיהוי נגיף SARS-CoV-2 בדגימות אנושיות על ידי הגברה איזותרמית בתיווך לולאה של שעתוק לאחור (RT-LAMP). שיטה זו, הנעשית תוך 60 דקות, יכולה להיות מותאמת לכל מעבדה או נקודת טיפול בעלות נמוכה ובאמצעות ציוד זול.

Abstract

נגיף תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) השפיע באופן דרמטי על בריאות האדם. זה ממשיך להיות איום על החברה המודרנית כי אנשים רבים מתים כתוצאה של זיהום. המחלה מאובחנת באמצעות בדיקות סרולוגיות ומולקולריות, כגון תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR). האחרון יש כמה חסרונות כי זה דורש תשתית מיוחדת, ציוד יקר, כוח אדם מיומן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את השלבים הנדרשים לזיהוי נגיף SARS-CoV-2 באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאת שעתוק לאחור (RT-LAMP) בדגימות אנושיות. הפרוטוקול כולל הוראות לתכנון פריימרים בסיליקו, הכנת ריאגנטים, הגברה והדמיה. לאחר סטנדרטיזציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות ומותאמת לכל מעבדה או נקודת טיפול בתוך 60 דקות בעלות נמוכה באמצעות ציוד זול. הוא מסתגל לאיתור פתוגנים שונים. לכן, זה יכול לשמש בשטח ובמרכזי בריאות לבצע מעקב אפידמיולוגי בזמן.

Introduction

תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) גורמת למחלת קורונה 2019 (COVID-19). ארגון הבריאות העולמי הכריז על מצב חירום לבריאות הציבור שמעורר דאגה בינלאומית ב-30 בינואר 2020 ועל מגפה עולמית ב-11 במרץ 2020. המגפה הביאה ליותר מ-760 מיליון מקרים ו-6.87 מיליון מקרי מוות נכון לתאריך כתיבת מאמר זה¹.

ההשפעה של וירוס זה הדגישה את הצורך בכלי מעקב טובים יותר, מדויקים יותר, מהירים יותר וזמינים יותר כדי לשפר את הזיהוי והבקרה של מחלות זיהומיות ^2,3. במהלך המגיפה, בדיקות אבחון SARS-CoV-2 התבססו על גילוי חומצת גרעין, נוגדנים וחלבונים, אך זיהוי RT-PCR של חומצת גרעין הוא....

Protocol

הדגימות ששימשו סופקו על ידי המעבדה הקלינית של בית החולים האוניברסיטאי Fundación Valle del Lili ותאמו את ה- RNA המטוהר מחולים שנבדקו חיוביים ל- COVID-19 באמצעות טכניקת RT-qPCR. כל החולים נתנו הסכמה מדעת למחקר, ומחקר זה אושר על ידי הוועדה הביו-אתית למחקרים בבני אדם מבית החולים האוניברסיטאי Fundación Valle del Lili.

1. עיצוב והכנה של פריימר RT-LAMP

הערה: ניתן להשתמש בפריימרים של LAMP עם מגוון פלטפורמות, כולל New England BioLabs (NEB) LAMP, Primer Explorer ו-LAMP assay versatile analysis (LAVA). עם זאת, עבור פרוטוקול זה, הכלי NEB LAMP שימש. תכנון פריימר יכול להיעשות באמצעות גנומים של SARS-CoV-2 המתקבלי....

תוצאות

יישום הפרוטוקול מתחיל בתכנון סט הפריימרים לכל גן מטרה בהתאם לפרוטוקול המתואר לעיל. ביוני 2020 התקבלו 5,000 גנומים של SARS-CoV-2 ממסד הנתונים NextStrain, עם ייצוג של 10% של הגנום הקולומביאני. רצפים אלה יושרו כדי לקבל את רצף הקונצנזוס ששימש בתהליך תכנון הפריימר. טבלה 1 מציגה את ערכת הפריימרים שנבחר.......

Discussion

למרות RT-LAMP נחשב כמתודולוגיה משלימה לביצוע אבחון מולקולרי, יש לו גם כמה מגבלות וצעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון כאשר הפרוטוקול הוא סטנדרטי ומיושק.

תקינת LAMP לזיהוי SARS-CoV-2 העריכה את הפרמטרים והרכיבים הבאים בתמהיל האב: (א) ריכוז וטמפרטורת היישור של הפריימרים; (ב) ריכוז האנזימים; (ג) .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.