Nachweis des SARS-CoV-2-Virus durch reverse Transkriptionsschleifen-vermittelte isotherme Amplifikation

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein vollständiges Protokoll zur Standardisierung und Implementierung der Methode zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus in menschlichen Proben durch reverse Transkriptionsschleifen-vermittelte isotherme Amplifikation (RT-LAMP) zur Verfügung. Diese Methode, die innerhalb von 60 Minuten durchgeführt wird, kann kostengünstig und mit kostengünstigen Geräten an jedes Labor oder jeden Point-of-Care angepasst werden.

Zusammenfassung

Das Virus des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hat dramatische Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Es ist nach wie vor eine Bedrohung für die moderne Gesellschaft, da viele Menschen an den Folgen einer Infektion sterben. Die Diagnose der Krankheit erfolgt mit serologischen und molekularen Tests, wie z. B. dem Goldstandard der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Letzteres hat mehrere Nachteile, da es eine spezielle Infrastruktur, teure Ausrüstung und geschultes Personal erfordert. Im Folgenden stellen wir ein Protokoll vor, das die Schritte beschreibt, die zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus mittels reverser Transkriptionsschleifen-vermittelter isothermer Amplifikation (RT-LAMP) in menschlichen Proben erforderlich sind. Das Protokoll enthält Anweisungen für das Design von Primern in silico, die Vorbereitung von Reagenzien, die Amplifikation und die Visualisierung. Einmal standardisiert, kann diese Methode innerhalb von 60 Minuten zu geringen Kosten und mit kostengünstigen Geräten einfach implementiert und an jedes Labor oder jeden Point-of-Care angepasst werden. Es ist anpassungsfähig, um verschiedene Krankheitserreger zu erkennen. Daher kann es potenziell vor Ort und in Gesundheitszentren eingesetzt werden, um eine rechtzeitige epidemiologische Überwachung durchzuführen.

Einleitung

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Die Weltgesundheitsorganisation erklärte am 30. Januar 2020 eine gesundheitliche Notlage von internationaler Tragweite und am 11. März 2020 eine Pandemie (Pandemie). Die Pandemie führte zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels zu über 760 Millionen Fällen und 6,87 Millionen Todesfällen¹.

Die Auswirkungen dieses Virus haben den Bedarf an besseren, genaueren, schnelleren und breiter verfügbaren Überwachungsinstrumenten zur Verbesserung der Erkennung und Kontrolle von Infektionskrankheiten deutl....

Protokoll

Die verwendeten Proben wurden vom klinischen Labor des Universitätskrankenhauses Fundación Valle del Lili zur Verfügung gestellt und entsprachen der gereinigten RNA von Patienten, die mit der RT-qPCR-Technik positiv auf COVID-19 getestet wurden. Alle Patienten gaben eine Einverständniserklärung für die Forschung ab, und diese Studie wurde von der bioethischen Kommission für Humanstudien des Universitätskrankenhauses Fundación Valle del Lili genehmigt.

1. Design und Vorbereitung der RT-LAMP-Grundierung

HINWEIS: LAMP-Primer können mit einer Vielzahl von Plattformen verwendet werden, einschließlich Ne....

Diskussion

Obwohl die RT-LAMP als ergänzende Methodik für die Durchführung molekularer Diagnostik angesehen wird, weist sie auch einige Einschränkungen und kritische Schritte auf, die bei der Standardisierung und Implementierung des Protokolls berücksichtigt werden müssen.

Die LAMP-Standardisierung für den Nachweis von SARS-CoV-2 bewertete die folgenden Parameter und Komponenten im Mastermix: (a) Konzentration und Temperatur der Ausrichtung der Primer; b) Konzentration der Enzyme; c) Magnesiumkonz.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.