A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول خطوات استخدام المنصة الآلية Lustro لإجراء توصيف عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية في الخميرة.

Abstract

يوفر علم البصريات الوراثي تحكما دقيقا في السلوك الخلوي من خلال استخدام البروتينات الحساسة للضوء المشفرة وراثيا. ومع ذلك ، فإن تحسين هذه الأنظمة لتحقيق الوظيفة المطلوبة غالبا ما يتطلب دورات متعددة لاختبار التصميم والبناء ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. ولمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير منصة لوسترو، وهي منصة تجمع بين التحفيز الضوئي وأتمتة المختبرات، مما يتيح الفحص الفعال عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية.

تستخدم Lustro محطة عمل أتمتة مزودة بجهاز إضاءة وجهاز اهتزاز وقارئ ألواح. من خلال استخدام ذراع روبوتية ، يقوم Lustro بأتمتة حركة لوحة microwell بين هذه الأجهزة ، مما يسمح بتحفيز سلالات البصريات الجينية وقياس استجابتها. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا حول استخدام Lustro لتوصيف أنظمة البصريات الوراثية للتحكم في التعبير الجيني في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae. يغطي البروتوكول إعداد مكونات Lustro ، بما في ذلك دمج جهاز الإضاءة مع محطة عمل الأتمتة. كما يوفر تعليمات مفصلة لبرمجة جهاز الإضاءة وقارئ اللوحات والروبوت ، مما يضمن التشغيل السلس والحصول على البيانات طوال العملية التجريبية.

Introduction

علم البصريات الوراثي هو تقنية قوية تستخدم البروتينات الحساسة للضوء للتحكم في سلوك الخلايا بدقةعالية 1،2،3. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولية للتركيبات الوراثية البصرية وتحديد ظروف الإضاءة المثلى يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تحسين أنظمة البصرياتالوراثية 4,5. يمكن للطرق عالية الإنتاجية لفحص وتوصيف نشاط الأنظمة الوراثية البصرية بسرعة تسريع دورة اختبار التصميم والبناء لاختبار تركيبات النماذج الأولية واستكشاف وظيفتها.

تم تطوير منصة Lustro كتقنية أتمتة للمختبرات مصممة لفحص وتوصيف أنظ....

Protocol

تم توثيق سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. تظهر هذه السلالات نموا قويا في نطاق درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية ويمكن زراعتها في مختلف وسائط الخميرة القياسية.

1. إعداد محطة عمل الأتمتة

  1. جهز محطة العمل الآلية بذراع قابض روبوتي (RGA ، انظر جدول المواد) قادر على تحريك ألواح microwell (الشكل 1).
  2. قم بتركيب شاكر سخان الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) في محطة العمل الآلية (الشكل 1 (1)) باستخدام آلية قفل اللوحة التلقائية التي توفر الوصول إلى RGA.

النتائج

يوضح الشكل 4 أ قيم التألق بمرور الوقت لسلالة بصرية وراثية تعبر عن مراسل فلوري يتحكم فيه عامل نسخ انقسام مستحث للضوء. تنعكس ظروف الإضاءة المختلفة المستخدمة في التجربة من خلال الاختلافات في دورة العمل ، والتي تمثل النسبة المئوية للوقت الذي يكون فيه الضوء مضاء. لوحظ أن مستوى ا.......

Discussion

يعمل بروتوكول Lustro المعروض هنا على أتمتة عمليات الزراعة والإضاءة والقياس ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصرياتالوراثية 6. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج جهاز الإضاءة وقارئ الألواح الدقيقة وجهاز الاهتزاز في محطة عمل الأتمتة. يوضح هذا البروتوكول على وجه التحديد فائد?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM128873 ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية 2045493 (منحت ل M.N.M.). ميغان نيكول ماكلين ، دكتوراه حاصلة على جائزة مهنية في الواجهة العلمية من صندوق بوروز ويلكوم. تم دعم ZPH من خلال منحة تدريب NHGRI لبرنامج التدريب على علوم الجينوم 5T32HG002760. نحن نقدر المناقشات المثمرة مع أعضاء مختبر ماكلين ، وعلى وجه الخصوص ، نحن ممتنون لكيران سويني لتقديم تعليقات على المخطوطة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glassCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (alternative illumination device)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper ArmTecanStandard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)Tecan
Synthetic Complete mediaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (user alert app)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

References

  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
  2. Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LustroOptogenetics Lustro Microwell Saccharomyces Cerevisiae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved