Experimentos de Optogenética de Alto Rendimento em Leveduras Usando a Plataforma Automatizada Lustro

Resumo

Este protocolo descreve as etapas para a utilização da plataforma automatizada Lustro para realizar a caracterização de alto rendimento de sistemas optogenéticos em leveduras.

Resumo

A optogenética oferece controle preciso sobre o comportamento celular utilizando proteínas sensíveis à luz codificadas geneticamente. No entanto, a otimização desses sistemas para alcançar a funcionalidade desejada geralmente requer vários ciclos de projeto-construção-teste, que podem ser demorados e trabalhosos. Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos o Lustro, uma plataforma que combina estimulação luminosa com automação laboratorial, permitindo triagem e caracterização eficientes de sistemas optogenéticos de alto rendimento.

A Lustro utiliza uma estação de trabalho de automação equipada com um dispositivo de iluminação, um dispositivo de agitação e um leitor de placas. Ao empregar um braço robótico, o Lustro automatiza o movimento de uma placa de micropoço entre esses dispositivos, permitindo a estimulação de cepas optogenéticas e a medição de sua resposta. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre o uso de Lustro para caracterizar sistemas optogenéticos para controle da expressão gênica em levedura brotante Saccharomyces cerevisiae. O protocolo abrange a configuração dos componentes do Lustro, incluindo a integração do dispositivo de iluminação com a estação de trabalho de automação. Ele também fornece instruções detalhadas para a programação do dispositivo de iluminação, leitor de placas e robô, garantindo uma operação suave e aquisição de dados durante todo o processo experimental.

Introdução

A optogenética é uma técnica poderosa que utiliza proteínas sensíveis à luz para controlar o comportamento das células com alta precisão ^1,2,3. No entanto, a prototipagem de construtos optogenéticos e a identificação de condições ótimas de iluminação podem ser demoradas, dificultando a otimização de sistemas optogenéticos ^4,5. Métodos de alto rendimento para selecionar e caracterizar rapidamente a atividade de sistemas optogenéticos podem acelerar o ciclo de projeto-construção-teste para prototipar construções e explo....

Protocolo

As linhagens de leveduras utilizadas neste estudo estão documentadas na Tabela de Materiais. Essas linhagens apresentam crescimento robusto dentro da faixa de temperatura de 22 °C a 30 °C e podem ser cultivadas em vários meios de levedura padrão.

1. Configurando a estação de trabalho de automação

1. Equipe a estação de trabalho automatizada com um braço robótico de garra (RGA, ver Tabela de Materiais) capaz de mover placas de micropoços (Figura 1).
2. Instale um agitador de aquecedor de microplacas (consulte Tabela de Materiais) na estação de trab....

Discussão

O protocolo Lustro aqui apresentado automatiza os processos de cultivo, iluminação e medição, permitindo a triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento⁶. Isso é conseguido integrando um dispositivo de iluminação, leitor de microplacas e dispositivo de agitação em uma estação de trabalho de automação. Este protocolo demonstra especificamente a utilidade de Lustro para a triagem de diferentes construtos optogenéticos integrados à levedura S. cerevisiae<.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500