Experimentos de Optogenética de Alto Rendimento em Leveduras Usando a Plataforma Automatizada Lustro

Resumo

Este protocolo descreve as etapas para a utilização da plataforma automatizada Lustro para realizar a caracterização de alto rendimento de sistemas optogenéticos em leveduras.

Resumo

A optogenética oferece controle preciso sobre o comportamento celular utilizando proteínas sensíveis à luz codificadas geneticamente. No entanto, a otimização desses sistemas para alcançar a funcionalidade desejada geralmente requer vários ciclos de projeto-construção-teste, que podem ser demorados e trabalhosos. Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos o Lustro, uma plataforma que combina estimulação luminosa com automação laboratorial, permitindo triagem e caracterização eficientes de sistemas optogenéticos de alto rendimento.

A Lustro utiliza uma estação de trabalho de automação equipada com um dispositivo de iluminação, um dispositivo de agitação e um leitor de placas. Ao empregar um braço robótico, o Lustro automatiza o movimento de uma placa de micropoço entre esses dispositivos, permitindo a estimulação de cepas optogenéticas e a medição de sua resposta. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre o uso de Lustro para caracterizar sistemas optogenéticos para controle da expressão gênica em levedura brotante Saccharomyces cerevisiae. O protocolo abrange a configuração dos componentes do Lustro, incluindo a integração do dispositivo de iluminação com a estação de trabalho de automação. Ele também fornece instruções detalhadas para a programação do dispositivo de iluminação, leitor de placas e robô, garantindo uma operação suave e aquisição de dados durante todo o processo experimental.

Introdução

A optogenética é uma técnica poderosa que utiliza proteínas sensíveis à luz para controlar o comportamento das células com alta precisão ^1,2,3. No entanto, a prototipagem de construtos optogenéticos e a identificação de condições ótimas de iluminação podem ser demoradas, dificultando a otimização de sistemas optogenéticos ^4,5. Métodos de alto rendimento para selecionar e caracterizar rapidamente a atividade de sistemas optogenéticos podem acelerar o ciclo de projeto-construção-teste para prototipar construções e explorar sua função.

A plataforma Lustro foi desenvolvida como uma técnica de automação laboratorial projetada para triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento. Ele integra um leitor de microplacas, dispositivo de iluminação e dispositivo de agitação com uma estação de trabalho de automação⁶. O Lustro combina cultura automatizada e estimulação luminosa de células em placas de micropoços (Figura 1 e Figura Suplementar 1), possibilitando a rápida triagem e comparação de diferentes sistemas optogenéticos. A plataforma Lustro é altamente adaptável e pode ser generalizada para trabalhar com outros robôs de automação laboratorial, dispositivos de iluminação, leitores de placas, tipos de células e sistemas optogenéticos, incluindo aqueles responsivos a diferentes comprimentos de onda de luz.

Este protocolo demonstra a configuração e o uso do Lustro para a caracterização de um sistema optogenético. O controle optogenético de fatores de transcrição divididos em leveduras é usado como um sistema de exemplo para ilustrar a função e utilidade da plataforma, investigando a relação entre entradas de luz e a expressão de um gene repórter fluorescente, mScarlet-I⁷. Ao seguir esse protocolo, os pesquisadores podem agilizar a otimização de sistemas optogenéticos e acelerar a descoberta de novas estratégias para o controle dinâmico de sistemas biológicos.

Protocolo

As linhagens de leveduras utilizadas neste estudo estão documentadas na Tabela de Materiais. Essas linhagens apresentam crescimento robusto dentro da faixa de temperatura de 22 °C a 30 °C e podem ser cultivadas em vários meios de levedura padrão.

1. Configurando a estação de trabalho de automação

1. Equipe a estação de trabalho automatizada com um braço robótico de garra (RGA, ver Tabela de Materiais) capaz de mover placas de micropoços (Figura 1).
2. Instale um agitador de aquecedor de microplacas (consulte Tabela de Materiais) na estação de trabalho automatizada (Figura 1(1)) com um mecanismo automático de bloqueio de placas que fornece acesso RGA.
3. Posicione um leitor de microplacas adjacente à estação de trabalho automatizada (Figura 1(2)), garantindo a acessibilidade da RGA.
4. Incorpore um dispositivo de iluminação de microplacas (Figura 1(3)) que permite acesso conveniente ao RGA. Exemplos incluem o optoPlate⁸ (como usado neste estudo) ou o LITOS⁹ (consulte a Tabela de Materiais).

2. Preparação do dispositivo de iluminação

1. Construir e calibrar a optoPlate (ou dispositivo alternativo de iluminação) seguindo métodos estabelecidos 8,10,11.
2. Utilize um adaptador no dispositivo de iluminação para permitir o acesso RGA.
3. Programe o optoPlate usando uma entrada de planilha¹⁰ ou uma interface gráfica¹². Siga o passo 3 para executar os programas de estimulação luminosa.

3. Projetando um programa de estimulação de luz

1. Determinar as condições de luz desejadas para o experimento.
2. Insira as condições de luz desejadas, incluindo intensidade da luz, hora de início da luz, comprimento do pulso, número de pulso e duração do interpulso, em uma planilha.
   NOTA: Atualize essas informações no optoPlate usando as instruções fornecidas no repositório do GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Lembre-se de que a placa de amostra não será iluminada enquanto estiver no leitor de microplacas ou no agitador do aquecedor. A duração e a frequência desses eventos podem exigir otimização com base em requisitos experimentais específicos.
3. Inclua condições escuras para cada cepa para permitir medições de fundo adequadas.
4. Para experimentos iniciais de caracterização para avaliar a funcionalidade do transformante, use uma alta intensidade de luz.
   OBS: A intensidade luminosa deve ser otimizada para experimentos mais sensíveis, pois o excesso de luz pode ser fototóxico para leveduras¹³.

4. Preparação do leitor de microplacas

1. Configure o leitor de microplacas para medir a quantidade desejada de interesse antes de realizar experimentos.
   Observação : neste exemplo, o leitor de microplaca foi configurado para medir a fluorescência de um repórter expresso pela cepa de interesse. Outras saídas, como luminescência ou densidade óptica, podem ser usadas dependendo dos requisitos experimentais.
2. Cultivar a cepa de interesse (juntamente com um controle não fluorescente) em meio sintético completo (SC)¹⁴ (ou outro meio de baixa fluorescência) (ver Tabela de Materiais) para a maior densidade celular a ser medida. Transfira as culturas para uma placa de micropoço com fundo de vidro de parede preta (consulte Tabela de Materiais) e meça-as para determinar as configurações ideais do leitor de microplacas.
   NOTA: Garanta leituras precisas inserindo corretamente as dimensões da placa e medindo a placa por baixo.
3. Consulte um banco de dados de proteínas fluorescentes (por exemplo, fpbase.org) para obter espectros aproximados de absorção e emissão para a proteína fluorescente alvo¹⁵.
4. Determine o valor z (distância entre a placa e o leitor) realizando uma varredura z em poços contendo as cepas fluorescentes e não fluorescentes. Selecione o valor z que produz a maior relação sinal-ruído.
5. Otimize os espectros de absorção e emissão realizando varreduras de absorção e emissão nas cepas fluorescentes e não fluorescentes para determinar a relação sinal-ruído ideal.
6. Meça a deformação fluorescente com o ganho ajustado para o nível ideal, determinando o maior ganho óptico que pode ser usado sem resultar em um erro de medição de transbordamento.
   NOTA: Esse ganho óptico deve ser definido manualmente de forma consistente em experimentos envolvendo a mesma deformação para garantir a consistência dos resultados.
7. Prepare um script de medição (consulte a Figura 2) no software leitor de microplacas. Este script configura o instrumento para medir a densidade óptica das culturas e os espectros de fluorescência de quaisquer proteínas fluorescentes a serem medidas.
   NOTA: Medir a densidade óptica das estirpes a 600 nm, a menos que expressem proteínas fluorescentes vermelhas. Para cepas que expressam proteínas fluorescentes vermelhas, medir a densidade óptica a 700 nm para evitar viés¹⁶.
8. Defina o script de medição para manter uma temperatura de incubação interna de 30 °C durante as medições.
9. Configure o script de medição para exportar os dados para uma planilha ou arquivos ASCII, de acordo com a preferência.

5. Programando o robô

1. Configure a definição da mesa de trabalho no software da estação de trabalho automatizada com base no layout físico dos transportadores (por exemplo, agitadores de aquecedor, plataformas de ninho, dispositivos de iluminação) e do material de laboratório (ou seja, a placa de 96 poços) (consulte a Tabela de Materiais). Crie um script no software da estação de trabalho de automação para executar indução de luz e medições (Figura 3), seguindo as etapas abaixo.
2. Desative quaisquer fontes de iluminação internas para impedir a ativação em segundo plano de sistemas optogenéticos.
3. Ajuste o agitador do aquecedor para manter uma temperatura de 30 °C. Quando a placa não estiver no agitador do aquecedor, ela estará à temperatura ambiente (22 °C).
4. Utilize loops, um temporizador e uma variável de contagem de loops para repetir as etapas de indução e medição das células em intervalos regulares.
5. Antes de registrar as medições, agite a placa de amostra para garantir a suspensão adequada de todas as células. Uma agitação de 60 s a 1.000 rpm com um orbital de 2 mm é geralmente suficiente para ressuspender as células S288C S. cerevisiae e evitar o viés de medição.
6. Mova a placa de amostra para o leitor de microplacas usando o braço do robô e remova a tampa (se aplicável) para evitar viés na medição da densidade óptica. O software de controle removerá e substituirá automaticamente a tampa para a posição designada se a definição do suporte do leitor de microplacas estiver definida para não permitir tampas.
7. Execute o script de medição do leitor de microplacas conforme descrito na etapa 4.
8. Substitua a tampa da placa de amostra e mova a placa para o dispositivo de iluminação usando o braço do robô.
9. Defina o script para aguardar até que o temporizador atinja o intervalo de tempo especificado (por exemplo, 30 min multiplicado pela variável de contagem de loop) e, em seguida, repita o loop inteiro para o número desejado de iterações (por exemplo, 48 vezes para um experimento de 24 horas).
10. Solucione possíveis erros e garanta o funcionamento adequado das definições de transportador e laboratório, bem como a capacidade do RGA de pegar e colocar a placa com precisão executando uma placa vazia através do loop de script várias vezes.
11. Configure alertas de usuário para notificar o usuário sobre quaisquer alterações ou erros de estado do instrumento que possam ocorrer durante a execução do protocolo.

6. Configuração da placa de amostra

1. Cultivar cepas de levedura em placas de mídia rica, como o ágar YPD¹⁷ (consulte a Tabela de Materiais). Inclua um controle não fluorescente (negativo).
2. Selecionar colônias das placas e inoculá-las em 3 mL de meio SC¹⁴ (ou outro meio de baixa fluorescência, como LFM¹⁸) em tubos de cultura de vidro. Incubar as culturas durante a noite a 30 °C em um tambor de rolo, mantendo-as no escuro ou sob condições de luz não responsiva (por exemplo, luz vermelha para sistemas responsivos à luz azul).
3. Medir a densidade óptica das culturas noturnas diluindo 200 μL de cada cultura em 1 mL de meio SC e registrando a densidade óptica a 600 nm (OD600) usando um espectrofotômetro ou leitor de microplacas.
4. Diluir cada cultura durante a noite para um OD₆₀₀ de 0,1 em tubos de cultura de vidro. Para testes de deformação de maior rendimento, execute diluições automatizadas em placas de micropoço.
5. Pipetar as culturas diluídas para a placa de 96 poços. Inclua poços triplicados para cada condição (ou seja, três poços idênticos com a mesma deformação e condição de luz) para levar em conta a variação técnica. Inclua poços com meios em branco e células não fluorescentes como controles negativos para medir a fluorescência de fundo e a densidade óptica.
6. Incubar a placa a 30 °C com agitação durante 5 h antes de iniciar a experiência de indução luminosa. Ajustar as quantidades de diluição e os tempos de incubação conforme necessário para otimizar para cepas específicas e condições experimentais.

7. Realização do experimento

1. Coloque a placa de amostra no agitador do aquecedor e inicie o script de automação conforme descrito na etapa 5.
2. Iniciar o programa de estimulação luminosa conforme descrito na etapa 3, uma vez registrada a medição inicial no leitor de placas.
3. Se a estação de trabalho de automação não estiver em uma sala escura, cubra-a com uma cortina blackout para evitar a iluminação de fundo.

8. Análise dos dados

1. Crie um mapa de planilha para o experimento, refletindo o layout 8 x 12 da placa de 96 poços. Certifique-se de que o mapa inclua os nomes das deformações que estão sendo medidas em uma grade e descrições das condições de luz usadas em outra grade.
2. Utilize um script Python ou outra linguagem de programação preferida para analisar os dados exportados. Importe a planilha de mapa para uma matriz, associando os nomes de tensão e nomes de condição com cada poço da placa.
   NOTA: O código de exemplo para análise pode ser encontrado em: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativamente, pode-se empregar um aplicativo para analisar dados de vários leitores de placas¹⁹.
3. Leia os dados da planilha de experimento exportada em outra matriz.
4. Gere gráficos dos valores de densidade óptica e fluorescência para cada deformação e condição ao longo do tempo, conforme ilustrado na Figura 4.
5. Examinar os gráficos de densidade óptica para determinar os estágios de crescimento exponencial ou saturação nas culturas. Essas informações ajudarão a selecionar os momentos apropriados para comparar as medições de fluorescência entre deformações ou condições, conforme ilustrado na Figura 5.

Resultados

A Figura 4A mostra os valores de fluorescência ao longo do tempo para uma cepa optogenética que expressa um repórter fluorescente controlado por um fator de transcrição dividido induzível por luz. As diferentes condições de luz utilizadas no experimento são refletidas por variações no ciclo de trabalho, que representa a porcentagem de tempo em que a luz está acesa. Observa-se que o nível de fluorescência global é proporcional ao ciclo de trabalho da estimulação luminosa.

Discussão

O protocolo Lustro aqui apresentado automatiza os processos de cultivo, iluminação e medição, permitindo a triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento⁶. Isso é conseguido integrando um dispositivo de iluminação, leitor de microplacas e dispositivo de agitação em uma estação de trabalho de automação. Este protocolo demonstra especificamente a utilidade de Lustro para a triagem de diferentes construtos optogenéticos integrados à levedura S. cerevisiae<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500