使用自动化平台 Lustro 在酵母中进行高通量光遗传学实验

摘要

该协议概述了利用自动化平台Lustro对酵母中的光遗传学系统进行高通量表征的步骤。

摘要

光遗传学通过利用基因编码的光敏蛋白提供对细胞行为的精确控制。然而，优化这些系统以实现所需的功能通常需要多个设计-构建-测试周期，这可能既耗时又费力。为了应对这一挑战，我们开发了 Lustro，这是一个将光刺激与实验室自动化相结合的平台，能够对光遗传学系统进行高效的高通量筛选和表征。

Lustro 使用配备照明装置、摇晃装置和读板器的自动化工作站。通过使用机械臂，Lustro 使微孔板在这些设备之间自动移动，从而可以刺激光遗传学菌株并测量其反应。该协议提供了使用Lustro表征用于萌 芽酵母酿酒酵母中基因表达控制的光遗传学系统的分步指南。该协议涵盖了 Lustro 组件的设置，包括照明设备与自动化工作站的集成。它还提供了对照明设备、读板机和机器人进行编程的详细说明，确保在整个实验过程中顺利运行和数据采集。

引言

光遗传学是一种强大的技术，它利用光敏蛋白来高精度地控制细胞的行为 ^1,2,3。然而，光遗传学结构的原型设计和确定最佳照明条件可能非常耗时，因此很难优化光遗传学系统^4,5。快速筛选和表征光遗传学系统活性的高通量方法可以加快设计-构建-测试周期，以对结构进行原型设计和探索其功能。

Lustro 平台是一种实验室自动化技术，专为光遗传学系统的高通量筛选和表征而设计。它将酶标仪、照明装置和振荡装置与自动化工作站6^{集成在一起。}Lustro 结合了微孔板中细胞的自动培养和光刺激（图 1 和补充图 1），能够快速筛选和比较不同的光遗传学系统。Lustro 平台具有很强的适应性，可以推广到与其他实验室自动化机器人、照明设备、酶标仪、细胞类型和光遗传学系统（包括对不同波长的光有响应的机器人）配合使用。

该协议演示了Lustro用于表征光遗传学系统的设置和使用。以酵母中分裂转录因子的光遗传学控制为例系....

研究方案

本研究中使用的酵母菌株记录在 材料表中。这些菌株在 22 °C 至 30 °C 的温度范围内表现出强劲的生长，并且可以在各种标准酵母培养基中培养。

1. 设置自动化工作站

1. 为自动化工作站配备能够移动微孔板的机器人夹持臂（RGA，参见 材料表）（图 1）。
2. 将微孔板加热器振荡器（见材料表）安装到自动化工作站（图1（1））中，并带有提供RGA访问的自动板锁定机构。
3. 将酶标仪放置在自动化工作站附近（图 1（2）），确保 RGA 可访问性。
4. 结合微孔板照明装置（图1（3）），方便RGA访问。示例包括 optoPlate⁸ （如本研究中使用的）或 LITOS⁹ （参见 材料表）。

讨论

本文介绍的 Lustro 协议可自动执行培养、照明和测量过程，从而实现光遗传学系统的高通量筛选和表征⁶。这是通过将照明设备、酶标仪和摇动设备集成到自动化工作站中来实现的。该协议特别证明了Lustro在筛选整合到 酵母酿酒酵 母中的不同光遗传学结构和比较光诱导程序的效用。

该协议中强调的几个关键步骤对于有效利用 Lustro 至关重要。仔细设计?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500