Высокопроизводительные оптогенетические эксперименты на дрожжах с использованием автоматизированной платформы Lustro

Резюме

В этом протоколе описаны шаги по использованию автоматизированной платформы Lustro для выполнения высокопроизводительной характеристики оптогенетических систем в дрожжах.

Аннотация

Оптогенетика обеспечивает точный контроль над поведением клеток, используя генетически закодированные светочувствительные белки. Однако оптимизация этих систем для достижения желаемой функциональности часто требует нескольких циклов проектирования-сборки-тестирования, что может быть трудоемким и трудоемким. Чтобы решить эту проблему, мы разработали Lustro, платформу, которая сочетает в себе световую стимуляцию с лабораторной автоматизацией, обеспечивая эффективный высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем.

Lustro использует автоматизированное рабочее место, оснащенное устройством освещения, встряхивающим устройством и считывателем номерных знаков. Используя роботизированную руку, Lustro автоматизирует перемещение микролунки между этими устройствами, позволяя стимулировать оптогенетические штаммы и измерять их реакцию. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по использованию Lustro для характеристики оптогенетических систем для контроля экспрессии генов у почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Протокол охватывает настройку компонентов Lustro, включая интеграцию осветительного устройства с автоматизированным рабочим местом. Он также содержит подробные инструкции по программированию осветительного устройства, считывателя пластин и робота, обеспечивая бесперебойную работу и сбор данных на протяжении всего экспериментального процесса.

Введение

Оптогенетика является мощным методом, который использует светочувствительные белки для управления поведением клеток с высокой точностью ^1,2,3. Однако прототипирование оптогенетических конструкций и определение оптимальных условий освещения может занимать много времени, что затрудняет оптимизацию оптогенетических систем ^4,5. Высокопроизводительные методы быстрого скрининга и определения характеристик активности оптогенетических систем могут ускорить цикл «проектирование-строительство-тестирование» для прототипирования ....

протокол

Штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании, описаны в таблице материалов. Эти штаммы демонстрируют устойчивый рост в диапазоне температур от 22 °C до 30 °C и могут культивироваться в различных стандартных дрожжевых средах.

1. Настройка автоматизированного рабочего места

1. Оснастите автоматизированную рабочую станцию роботизированным захватом (RGA, см. таблицу материалов), способным перемещать планшеты с микролунками (рис. 1).
2. Установите встряхиватель микропластинчатого нагревателя (см. Таблицу материалов) в автоматизир....

Результаты

На рисунке 4А показаны значения флуоресценции с течением времени для оптогенетического штамма, экспрессирующего флуоресцентный репортер, контролируемый светоиндуцируемым расщепленным транскрипционным фактором. Различные условия освещения, используемые в экспериме.......

Обсуждение

Протокол Lustro, представленный здесь, автоматизирует процессы культивирования, освещения и измерения, обеспечивая высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем⁶. Это достигается за счет интеграции осветительного устройства, считыва.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500