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요약

이 프로토콜은 자동화된 플랫폼 Lustro를 활용하여 효모의 광유전학 시스템의 고처리량 특성 분석을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

초록

광유전학은 유전적으로 인코딩된 빛에 민감한 단백질을 활용하여 세포 행동을 정밀하게 제어합니다. 그러나 원하는 기능을 달성하기 위해 이러한 시스템을 최적화하려면 여러 설계-구축-테스트 주기가 필요한 경우가 많으며, 이는 시간과 노동 집약적일 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 광 자극과 실험실 자동화를 결합한 플랫폼인 Lustro를 개발하여 광유전학 시스템의 효율적인 고처리량 스크리닝 및 특성 분석을 가능하게 합니다.

Lustro는 조명 장치, 진탕 장치 및 플레이트 리더가 장착된 자동화 워크스테이션을 사용합니다. Lustro는 로봇 팔을 사용하여 이러한 장치 사이의 마이크로웰 플레이트 이동을 자동화하여 광유전학적 균주를 자극하고 반응을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Lustro를 사용하여 신생 효모 Saccharomyces cerevisiae의 유전자 발현 조절을 위한 광유전학 시스템을 특성화하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜은 조명 장치와 자동화 워크스테이션의 통합을 포함하여 Lustro의 구성 요소 설정을 다룹니다. 또한 조명 장치, 플레이트 리더 및 로봇을 프로그래밍하기 위한 자세한 지침을 제공하여 실험 프로세스 전반에 걸쳐 원활한 작동과 데이터 수집을 보장합니다.

서문

광유전학은 빛에 민감한 단백질을 활용하여 세포의 거동을 고정밀도로 제어하는 강력한 기술입니다 1,2,3. 그러나, 광유전학적 구성물의 프로토타이핑과 최적의 조명 조건을 식별하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 이는 광유전학 시스템을 최적화하기 어렵게 만든다 4,5. 광유전학 시스템의 활성을 신속하게 스크리닝하고 특성화하는 고처리량 분석법은 구성물의 프로토타이핑 및 기능 탐색을 위한 설계-구축-테스트 주기를 가속화할 수 있습니다.

Lustro 플랫폼은 광유전학 시스템의 고처리량 스크리닝 및 특성화를 위해 설계된 실험실 자동화 기술로 개발되었습니다. 마이크로플레이트 리더, 조명 장치 및 진탕 장치를 자동화 워크스테이션(6)과 통합합니다. Lustro는 마이크로웰 플레이트(그림 1 및 보충 그림 1)에서 세포의 자동 배양과 광 자극을 결합하여 다양한 광유전학 시스템을 신속하게 스크리닝하고 비교할 수 있습니다. Lustro 플랫폼은 적응성이 뛰어나며 다른 실험실 자동화 로봇, 조명 장치, 플레이트 리더, 세포 유형 및 다양한 파장의 빛에 반응하는 시스템을 포함한 광유전학 시스템과 함께 작동하도록 일반화할 수 있습니다.

이 프로토콜은 광유전학 시스템을 특성화하기 위한 Lustro의 설정 및 사용을 보여줍니다. 효모의 분할 전사 인자의 광유전학적 제어는 광 입력과 형광 리포터 유전자인 mScarlet-I7의 발현 사이의 관계를 조사하여 플랫폼의 기능과 유용성을 설명하기 위한 예제 시스템으로 사용됩니다. 이 프로토콜을 따름으로써 연구자들은 광유전학 시스템의 최적화를 간소화하고 생물학적 시스템의 동적 제어를 위한 새로운 전략의 발견을 가속화할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 효모 균주는 재료 표에 문서화되어 있습니다. 이들 균주는 22°C 내지 30°C의 온도 범위 내에서 강력한 성장을 나타내며 다양한 표준 효모 배지에서 배양할 수 있습니다.

1. 자동화 워크스테이션 설정

  1. 자동화된 워크스테이션에 마이크로웰 플레이트를 이동할 수 있는 로봇 그리퍼 암(RGA, 재료 표 참조)을 장착합니다(그림 1).
  2. RGA 액세스를 제공하는 자동 플레이트 잠금 메커니즘을 사용하여 마이크로플레이트 히터 셰이커(재료 표 참조)를 자동화된 워크스테이션(그림 1(1))에 설치합니다.
  3. 마이크로플레이트 리더를 자동화된 워크스테이션 옆에 배치하여(그림 1(2)) RGA 접근성을 보장합니다.
  4. 편리한 RGA 액세스를 허용하는 마이크로플레이트 조명 장치(그림 1(3))를 통합합니다. 예를 들어 optoPlate8 (이 연구에서 사용됨) 또는 LITOS9 ( 재료 표 참조)가 있습니다.

2. 조명 장치의 준비

  1. 확립된 방법 8,10,11에 따라 optoPlate(또는 대체 조명 장치)를 구성하고 보정합니다.
  2. 조명 장치의 어댑터를 사용하여 RGA 액세스를 활성화합니다.
  3. 스프레드시트 입력(10 ) 또는 그래픽 인터페이스(12)를 사용하여 optoPlate를 프로그래밍합니다. 3단계에 따라 빛 자극 프로그램을 실행합니다.

3. 빛 자극 프로그램 설계

  1. 실험에 필요한 조명 조건을 결정합니다.
  2. 광도, 광 시작 시간, 펄스 길이, 펄스 수, 인터펄스 지속 시간 등 원하는 조명 조건을 스프레드시트에 입력합니다.
    알림: GitHub 리포지토리에 제공된 지침을 사용하여 이 정보를 optoPlate에 플래시합니다 github.com/mccleanlab/Optoplate-96. 샘플 플레이트는 마이크로플레이트 리더 또는 히터 셰이커에 있는 동안에는 조명이 켜지지 않습니다. 이러한 이벤트의 지속 시간과 빈도는 특정 실험 요구 사항에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
  3. 적절한 배경 측정이 가능하도록 각 균주에 대한 어두운 조건을 포함합니다.
  4. 형질전환 기능을 평가하기 위한 초기 특성화 실험의 경우 높은 광도를 사용합니다.
    알림: 과도한 빛은 효모에 광독성이 있을 수 있으므로 광도는 보다 민감한 실험에 최적화되어야 합니다13.

4. 마이크로플레이트 리더의 준비

  1. 실험을 수행하기 전에 원하는 관심 수량을 측정하도록 마이크로플레이트 리더를 구성합니다.
    NOTE: 이 예에서 마이크로플레이트 리더는 관심 균주로 표현되는 리포터의 형광을 측정하도록 구성되었습니다. 발광 또는 광학 밀도와 같은 다른 출력은 실험 요구 사항에 따라 사용할 수 있습니다.
  2. 합성 완전(SC) 배지(14 ) (또는 다른 저 형광 배지)( 재료 표 참조)에서 측정 할 가장 높은 세포 밀도까지 관심 균주(비형광 대조군과 함께)를 배양합니다. 배양액을 유리 바닥의 검은색 벽으로 된 마이크로웰 플레이트( 재료 표 참조)로 옮기고 측정하여 최적의 마이크로플레이트 리더 설정을 결정합니다.
    알림: 플레이트 치수를 올바르게 입력하고 아래에서 플레이트를 측정하여 정확한 판독값을 보장합니다.
  3. 표적 형광 단백질(15)에 대한 대략적인 흡수 및 방출 스펙트럼을 얻기 위해 형광 단백질 데이터베이스(예를 들어, fpbase.org)를 참조한다.
  4. 형광 균주와 비형광 균주가 포함된 웰에서 z-스캔을 수행하여 z-값(플레이트와 리더 사이의 거리)을 결정합니다. 가장 높은 신호 대 잡음비를 산출하는 z-값을 선택합니다.
  5. 형광 및 비형광 균주에 대한 흡수 및 방출 스캔을 수행하여 흡수 및 방출 스펙트럼을 최적화하여 최적의 신호 대 잡음비를 결정합니다.
  6. 게인을 최적 수준으로 설정하여 형광 스트레인을 측정하여 오버플로 측정 오류 없이 사용할 수 있는 가장 높은 광학 게인을 결정합니다.
    참고: 이 광학 이득은 결과의 일관성을 보장하기 위해 동일한 변형률을 포함하는 실험에서 일관되게 수동으로 설정해야 합니다.
  7. 마이크로플레이트 리더 소프트웨어에서 측정 스크립트( 그림 2 참조)를 준비합니다. 이 스크립트는 배양물의 광학 밀도와 측정할 형광 단백질의 형광 스펙트럼을 측정하도록 기기를 구성합니다.
    NOTE: 적색 형광 단백질을 발현하지 않는 한 600nm에서 균주의 광학 밀도를 측정합니다. 적색 형광 단백질을 발현하는 균주의 경우, 편향을 피하기 위해 700nm에서 광학 밀도를 측정한다16.
  8. 측정 중에 내부 배양 온도를 30°C로 유지하도록 측정 스크립트를 설정합니다.
  9. 기본 설정에 따라 데이터를 스프레드시트 또는 ASCII 파일로 내보내도록 측정 스크립트를 구성합니다.

5. 로봇 프로그래밍

  1. 캐리어(예: 히터 셰이커, 네스트 플랫폼, 조명 장치) 및 실험기구(예: 96웰 플레이트)의 물리적 레이아웃을 기반으로 자동화된 워크스테이션 소프트웨어에서 작업대 정의를 구성합니다( 재료 표 참조). 자동화 워크스테이션 소프트웨어에서 아래 단계에 따라 광 유도 및 측정을 실행하는 스크립트를 생성합니다(그림 3).
  2. 광유전학 시스템의 백그라운드 활성화를 방지하기 위해 내부 조명 소스를 비활성화합니다.
  3. 히터 셰이커를 30°C의 온도를 유지하도록 설정합니다. 플레이트가 히터 셰이커에 있지 않으면 주변 온도(22°C)에 있습니다.
  4. 루프, 타이머 및 루프 카운팅 변수를 활용하여 일정한 간격으로 세포를 유도하고 측정하는 단계를 반복합니다.
  5. 측정값을 기록하기 전에 샘플 플레이트를 흔들어 모든 세포가 적절하게 현탁되도록 합니다. 2mm 오비탈을 사용하여 1,000rpm에서 60초 흔들리는 일반적으로 S288C S. cerevisiae 세포를 재현탁시키고 측정 편향을 방지하기에 충분합니다.
  6. 로봇 팔을 사용하여 샘플 플레이트를 마이크로플레이트 리더로 이동하고 뚜껑(해당되는 경우)을 제거하여 광학 밀도 측정의 편향을 방지합니다. 제어 소프트웨어는 마이크로플레이트 리더 캐리어 정의가 뚜껑을 허용하지 않도록 설정된 경우 자동으로 뚜껑을 제거하고 지정된 위치로 교체합니다.
  7. 4단계에서 설명한 대로 마이크로플레이트 리더 측정 스크립트를 실행합니다.
  8. 샘플 플레이트의 뚜껑을 교체하고 로봇 팔을 사용하여 플레이트를 조명 장치로 이동합니다.
  9. 타이머가 지정된 시간 간격(예: 30분에 루프 카운팅 변수를 곱한 값)에 도달할 때까지 기다렸다가 원하는 반복 횟수(예: 24시간 실험의 경우 48회)에 대해 전체 루프를 반복하도록 스크립트를 설정합니다.
  10. 잠재적인 오류를 해결하고 캐리어 및 실험기구 정의의 적절한 기능을 보장할 뿐만 아니라 스크립트 루프를 통해 빈 플레이트를 여러 번 실행하여 플레이트를 정확하게 픽업하고 배치하는 RGA의 기능을 보장합니다.
  11. 프로토콜 실행 중에 발생할 수 있는 계측기 상태 변경 또는 오류를 사용자에게 알리도록 사용자 경고를 구성합니다.

6. 샘플 플레이트 설정

  1. YPD 한천17 과 같은 리치 배지 플레이트에서 효모 균주를 성장시킵니다( 재료 표 참조). 비형광(음성) 대조군을 포함합니다.
  2. 플레이트에서 콜로니를 선택하고 유리 배양관에서 3mL의 SC 배지(14 )(또는 LFM18과 같은 다른 저형광 배지)에 접종합니다. 배양액을 롤러 드럼에서 30°C에서 밤새 배양하면서 어두운 곳이나 반응이 없는 조명 조건(예: 청색광에 반응하는 시스템의 경우 적색광)에서 배양합니다.
  3. 각 배양액 200μL를 SC 배지 1mL에 희석하고 분광광도계 또는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600nm(OD600)에서 광학 밀도를 기록하여 야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다.
  4. 유리 배양관에서 각 야간 배양액을 OD600 0.1로 희석합니다. 더 높은 처리량의 변형률 테스트를 위해 마이크로웰 플레이트에서 자동 희석을 수행하십시오.
  5. 희석된 배양액을 96웰 플레이트에 피펫팅합니다. 기술적 변동을 설명하기 위해 각 조건에 대한 3개의 웰(즉, 동일한 변형률 및 조명 조건을 가진 3개의 동일한 웰)을 포함합니다. 빈 배지와 비형광 세포가 있는 웰을 음성 대조군으로 포함하여 배경 형광 및 광학 밀도를 측정합니다.
  6. 광 유도 실험을 시작하기 전에 30°C에서 5시간 동안 흔들면서 플레이트를 배양합니다. 특정 균주 및 실험 조건에 맞게 최적화하기 위해 필요에 따라 희석량과 배양 시간을 조정합니다.

7. 실험 수행

  1. 샘플 플레이트를 히터 셰이커에 놓고 5단계에 설명된 대로 자동화 스크립트를 시작합니다.
  2. 플레이트 리더의 초기 측정이 기록되면 3단계에 설명된 대로 광 자극 프로그램을 시작합니다.
  3. 자동화 워크스테이션이 어두운 방에 있지 않은 경우 배경 조명을 피하기 위해 암막 커튼으로 덮으십시오.

8. 데이터 분석

  1. 96웰 플레이트의 8 x 12 레이아웃을 반영하여 실험을 위한 스프레드시트 맵을 생성합니다. 맵에 한 그리드에서 측정되는 변형률의 이름과 다른 그리드에서 사용되는 조명 조건에 대한 설명이 포함되어 있는지 확인합니다.
  2. Python 스크립트 또는 다른 기본 프로그래밍 언어를 사용하여 내보낸 데이터를 분석합니다. 맵 스프레드시트를 배열로 가져와서 변형률 이름과 상태 이름을 플레이트의 각 웰과 연결합니다.
    참고: 분석을 위한 샘플 코드는 다음에서 찾을 수 있습니다. https://github.com/mccleanlab/Lustro. 대안적으로, 다양한 플레이트 리더(19)로부터의 데이터를 구문 분석하기 위한 어플리케이션을 채용할 수 있다.
  3. 내보낸 실험 스프레드시트의 데이터를 다른 배열로 읽어 들입니다.
  4. 그림 4와 같이 시간 경과에 따른 각 변형률과 조건에 대한 optical density 값과 fluorescence 값의 플롯을 생성합니다.
  5. 광학 밀도 플롯을 검사하여 배양물의 기하급수적 성장 또는 포화 단계를 결정합니다. 이 정보는 그림 5와 같이 균주 또는 조건 간의 형광 측정값을 비교하기 위한 적절한 시점을 선택하는 데 도움이 됩니다.

결과

그림 4A 는 광 유도성 분할 전사 인자에 의해 제어되는 형광 리포터를 발현하는 광유전학 균주에 대한 시간 경과에 따른 형광 값을 보여줍니다. 실험에 사용된 다양한 조명 조건은 조명이 켜져 있는 시간의 백분율을 나타내는 듀티 사이클의 변화에 의해 반영됩니다. 전체 형광 수준은 광 자극의 듀티 사이클에 비례하는 것으로 관찰됩니다. 그림 4B 는 동...

토론

여기에 제시된 Lustro 프로토콜은 배양, 조명 및 측정 프로세스를 자동화하여 광유전학 시스템의 고처리량 스크리닝 및 특성 분석을 가능하게 합니다6. 이는 조명 장치, 마이크로플레이트 리더 및 진탕 장치를 자동화 워크스테이션에 통합함으로써 달성됩니다. 이 프로토콜은 효모 S. cerevisiae 에 통합된 다양한 광유전학적 구조를 스크리닝하고 광 유도 프로그램을 비교하기 ?...

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 R35GM128873과 국립과학재단(National Science Foundation)의 보조금 2045493(M.N.M.에 수여)의 지원을 받았습니다. Megan Nicole McClean 박사는 Burroughs Wellcome Fund의 Scientific Interface에서 Career Award를 수상했습니다. ZPH는 게놈 과학 교육 프로그램 5T32HG002760에 대한 NHGRI 교육 보조금의 지원을 받았습니다. 우리는 McClean 연구소 구성원들과의 유익한 토론을 인정하며, 특히 원고에 대한 의견을 제공해 준 Kieran Sweeney에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glassCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (alternative illumination device)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper ArmTecan
Spark (plate reader)Tecan
Synthetic Complete mediaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (user alert app)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

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