자동화된 플랫폼 Lustro를 사용한 효모의 고처리량 광유전학 실험

요약

이 프로토콜은 자동화된 플랫폼 Lustro를 활용하여 효모의 광유전학 시스템의 고처리량 특성 분석을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

초록

광유전학은 유전적으로 인코딩된 빛에 민감한 단백질을 활용하여 세포 행동을 정밀하게 제어합니다. 그러나 원하는 기능을 달성하기 위해 이러한 시스템을 최적화하려면 여러 설계-구축-테스트 주기가 필요한 경우가 많으며, 이는 시간과 노동 집약적일 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 광 자극과 실험실 자동화를 결합한 플랫폼인 Lustro를 개발하여 광유전학 시스템의 효율적인 고처리량 스크리닝 및 특성 분석을 가능하게 합니다.

Lustro는 조명 장치, 진탕 장치 및 플레이트 리더가 장착된 자동화 워크스테이션을 사용합니다. Lustro는 로봇 팔을 사용하여 이러한 장치 사이의 마이크로웰 플레이트 이동을 자동화하여 광유전학적 균주를 자극하고 반응을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Lustro를 사용하여 신생 효모 Saccharomyces cerevisiae의 유전자 발현 조절을 위한 광유전학 시스템을 특성화하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜은 조명 장치와 자동화 워크스테이션의 통합을 포함하여 Lustro의 구성 요소 설정을 다룹니다. 또한 조명 장치, 플레이트 리더 및 로봇을 프로그래밍하기 위한 자세한 지침을 제공하여 실험 프로세스 전반에 걸쳐 원활한 작동과 데이터 수집을 보장합니다.

서문

광유전학은 빛에 민감한 단백질을 활용하여 세포의 거동을 고정밀도로 제어하는 강력한 기술입니다 ^1,2,3. 그러나, 광유전학적 구성물의 프로토타이핑과 최적의 조명 조건을 식별하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 이는 광유전학 시스템을 최적화하기 어렵게 만든다 ^4,5. 광유전학 시스템의 활성을 신속하게 스크리닝하고 특성화하는 고처리량 분석법은 구성물의 프로토타이핑 및 기능 탐색을 위한 설계-구축-테스트 주기를 가속화할 수 있습니다.

Lustro 플랫폼은 광유전학 시스템의 고처리량 스크리닝 및 특성화를 위해 설계된 실험실 자동화 기술로 개발되었습니다. 마이크로플레이트 리더, 조명 장치 및 진탕 장치를 자동화 워크스테이션(⁶)과 통합합니다. Lustro는 마이크로웰 플레이트(그림 1 및 보충 그림 1)에서 세포의 자동 배양과 광 자극을 결합하여 다양한....

프로토콜

이 연구에 사용된 효모 균주는 재료 표에 문서화되어 있습니다. 이들 균주는 22°C 내지 30°C의 온도 범위 내에서 강력한 성장을 나타내며 다양한 표준 효모 배지에서 배양할 수 있습니다.

1. 자동화 워크스테이션 설정

1. 자동화된 워크스테이션에 마이크로웰 플레이트를 이동할 수 있는 로봇 그리퍼 암(RGA, 재료 표 참조)을 장착합니다(그림 1).
2. RGA 액세스를 제공하는 자동 플레이트 잠금 메커니즘을 사용하여 마이크로플레이트 히터 셰이커(재료 표 참조)를 자동화된 워크스테이션(그림 1(1))에 설치합니다.
3. 마이크로플레이트 리더를 자동화된 워크스테이션 옆에 배치하여(그림 1(2)) RGA 접근성을 보장합니다.
4. 편리한 RGA 액세스를 허용하는 마이크로플레이트 조명 장치(그림 1

토론

여기에 제시된 Lustro 프로토콜은 배양, 조명 및 측정 프로세스를 자동화하여 광유전학 시스템의 고처리량 스크리닝 및 특성 분석을 가능하게 합니다⁶. 이는 조명 장치, 마이크로플레이트 리더 및 진탕 장치를 자동화 워크스테이션에 통합함으로써 달성됩니다. 이 프로토콜은 효모 S. cerevisiae 에 통합된 다양한 광유전학적 구조를 스크리닝하고 광 유도 프로그램을 비교하기 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500