Otomatik platform Lustro kullanılarak mayada yüksek verimli optogenetik deneyler

Özet

Bu protokol, mayadaki optogenetik sistemlerin yüksek verimli karakterizasyonunu gerçekleştirmek için otomatik platform Lustró'yu kullanma adımlarını özetlemektedir.

Özet

Optogenetik, genetik olarak kodlanmış ışığa duyarlı proteinleri kullanarak hücresel davranış üzerinde hassas kontrol sağlar. Bununla birlikte, istenen işlevselliği elde etmek için bu sistemleri optimize etmek, genellikle zaman alıcı ve emek yoğun olabilen birden fazla tasarım-yapı-test döngüsü gerektirir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, ışık stimülasyonunu laboratuvar otomasyonu ile birleştiren, optogenetik sistemlerin verimli yüksek verimli taramasını ve karakterizasyonunu sağlayan bir platform olan Lustro'yu geliştirdik.

Lustró, bir aydınlatma cihazı, bir sallama cihazı ve bir plaka okuyucu ile donatılmış bir otomasyon iş istasyonu kullanır. Lustró, robotik bir kol kullanarak, bu cihazlar arasında bir mikrokuyu plakasının hareketini otomatikleştirerek optogenetik suşların uyarılmasına ve tepkilerinin ölçülmesine olanak tanır. Bu protokol, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae'de gen ekspresyon kontrolü için optogenetik sistemleri karakterize etmek için Lustro kullanımı hakkında adım adım bir kılavuz sağlar. Protokol, aydınlatma cihazının otomasyon iş istasyonuyla entegrasyonu da dahil olmak üzere Lustro bileşenlerinin kurulumunu kapsar. Ayrıca aydınlatma cihazını, plaka okuyucuyu ve robotu programlamak için ayrıntılı talimatlar sağlayarak deney süreci boyunca sorunsuz çalışma ve veri toplama sağlar.

Giriş

Optogenetik, hücrelerin davranışını yüksek hassasiyetle^kontrol etmek için ışığa duyarlı proteinleri kullanan güçlü bir tekniktir ^1,2,3. Bununla birlikte, optogenetik yapıların prototiplenmesi ve optimum aydınlatma koşullarının belirlenmesi zaman alıcı olabilir^ve bu da optogenetik sistemleri optimize etmeyi zorlaştırır ^4,5. Optogenetik sistemlerin aktivitesini hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için yüksek verimli yöntemler, yapıların prototiplenmesi ve işlevlerinin keşfedilmesi için tasarım-yapı-test döngü....

Protokol

Bu çalışmada kullanılan maya suşları Malzeme Tablosunda belgelenmiştir. Bu suşlar, 22 °C ila 30 °C sıcaklık aralığında sağlam bir büyüme sergiler ve çeşitli standart maya ortamlarında yetiştirilebilir.

1. Otomasyon iş istasyonunun kurulması

1. Otomatik iş istasyonunu, mikro kuyu plakalarını hareket ettirebilen bir Robotik Tutucu Kol (RGA, Malzeme Tablosuna bakın) ile donatın (Şekil 1).
2. RGA erişimi sağlayan otomatik bir plaka kilitleme mekanizmasına sahip otomatik iş istasyonuna (Şekil 1(1)) bir mikroplaka ısıtıcı ç....

Tartışmalar

Burada sunulan Lustro protokolü, kültürleme, aydınlatma ve ölçüm süreçlerini otomatikleştirerek optogenetik sistemlerin yüksek verimli taranmasını ve karakterizasyonunu sağlar⁶. Bu, bir aydınlatma cihazı, mikroplaka okuyucu ve çalkalama cihazının bir otomasyon iş istasyonuna entegre edilmesiyle elde edilir. Bu protokol, özellikle Lustro'nun maya S. cerevisiae'ye entegre edilmiş farklı optogenetik yapıları taramak ve ışık indüksiyon programlarını karşılaşt.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500