自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験

要約

このプロトコルでは、自動化されたプラットフォーム Lustro を利用して、酵母の光遺伝学的システムのハイスループット特性評価を実行する手順を概説します。

要約

オプトジェネティクスは、遺伝的にコードされた光感受性タンパク質を利用することで、細胞の挙動を正確に制御します。しかし、これらのシステムを最適化して目的の機能を実現するには、多くの場合、設計、構築、テストのサイクルを複数回必要とし、時間と労力がかかります。この課題に対処するために、光刺激とラボラトリーオートメーションを組み合わせたプラットフォームであるLustroを開発し、オプトジェネティックシステムの効率的なハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にしました。

Lustro は、照明装置、振とう装置、プレートリーダーを備えた自動化ワークステーションを利用しています。Lustroは、ロボットアームを採用することで、これらのデバイス間のマイクロウェルプレートの移動を自動化し、光遺伝学的株の刺激とその応答の測定を可能にします。このプロトコルは出芽のイースト Saccharomycesのcerevisiaeの遺伝子発現制御のための光遺伝学システムを特徴付けるのにLustroの使用のステップバイステップガイドを提供する。このプロトコルは、照明装置とオートメーションワークステーションの統合など、Lustroのコンポーネントのセットアップをカバーしています。また、照明装置、プレートリーダー、ロボットのプログラミングに関する詳細な指示も提供し、実験プロセス全体を通してスムーズな操作とデータ取得を保証します。

概要

オプトジェネティクスは、光感受性タンパク質を利用して細胞の挙動を高精度に制御する強力な技術です^1,2,3。しかし、オプトジェネティックコンストラクトのプロトタイピングと最適な照明条件の特定には時間がかかる場合があり、オプトジェネティックシステムの最適化は困難です^4,5。オプトジェネティックシステムの活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するハイスループットメソッドは、コンストラクトのプロトタイピングとその機能の調査のための設計、構築、テストのサイクルを加速させることができます。

Lustro プラットフォームは、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価のために設計されたラボラトリーオートメーション技術として開発されました。マイクロプレートリーダー、照明装置、振とう装置をオートメーションワークステーション⁶と統合しています。Lustro は、マイクロウェルプレート(図1および補足図1)で細胞の自動培養と光刺激を組み合わ....

プロトコル

この研究で利用した酵母菌株は、 材料表に記載されています。これらの菌株は、22°C〜30°Cの温度範囲で強力な増殖を示し、さまざまな標準酵母培地で培養できます。

1. 自動化ワークステーションのセットアップ

1. マイクロウェルプレートを移動できるロボットグリッパーアーム(RGA、 材料表を参照)を自動ワークステーションに装備します(図1)。
2. マイクロプレートヒーターシェーカー(材料表を参照)を自動ワークステーション(図1(1))に設置し、RGAアクセスを提供する自動プレートロック機構を備えています。
3. マイクロプレートリーダーを自動ワークステーションに隣接して配置し(図1(2))、RGAへのアクセスを確保します。
4. RGAへのアクセスに便利なマイクロプレート照明装置(図1(3))を組み込みます。例としては、optoPlate

ディスカッション

ここで紹介するLustroプロトコルは、培養、照明、測定プロセスを自動化し、光遺伝^{学的システムのハイ}スループットスクリーニングと特性評価を可能にします6。これは、照明装置、マイクロプレートリーダー、振とう装置をオートメーションワークステーションに統合することで実現されます。このプロトコルは、酵母 S.cerevisiae に統合されたさまざまな光遺伝学的?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500