Experimentos de optogenética de alto rendimiento en levaduras utilizando la plataforma automatizada Lustro

Resumen

Este protocolo describe los pasos para utilizar la plataforma automatizada Lustro para realizar una caracterización de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos en levaduras.

Resumen

La optogenética ofrece un control preciso sobre el comportamiento celular mediante la utilización de proteínas sensibles a la luz codificadas genéticamente. Sin embargo, la optimización de estos sistemas para lograr la funcionalidad deseada a menudo requiere múltiples ciclos de diseño, construcción y prueba, que pueden llevar mucho tiempo y mano de obra. Para hacer frente a este reto, hemos desarrollado Lustro, una plataforma que combina la estimulación lumínica con la automatización del laboratorio, lo que permite un cribado y caracterización eficientes de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos.

Lustro utiliza una estación de trabajo de automatización equipada con un dispositivo de iluminación, un dispositivo de agitación y un lector de placas. Mediante el empleo de un brazo robótico, Lustro automatiza el movimiento de una placa de micropocillos entre estos dispositivos, lo que permite la estimulación de cepas optogenéticas y la medición de su respuesta. Este protocolo proporciona una guía paso a paso sobre el uso de Lustro para caracterizar los sistemas optogenéticos para el control de la expresión génica en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. El protocolo cubre la configuración de los componentes de Lustro, incluida la integración del dispositivo de iluminación con la estación de trabajo de automatización. También proporciona instrucciones detalladas para programar el dispositivo de iluminación, el lector de placas y el robot, lo que garantiza un funcionamiento fluido y la adquisición de datos durante todo el proceso experimental.

Introducción

La optogenética es una técnica poderosa que utiliza proteínas sensibles a la luz para controlar el comportamiento de las células con alta precisión ^1,2,3. Sin embargo, la creación de prototipos de construcciones optogenéticas y la identificación de las condiciones óptimas de iluminación pueden llevar mucho tiempo, lo que dificulta la optimización de los sistemas optogenéticos ^4,5. Los métodos de alto rendimiento para detectar y caracterizar rápidamente la actividad de los sistemas optogenéticos pueden acelerar el ciclo de diseño, construcción y prueba para la creación de prototipos de construcciones y la exploración de su función.

La plataforma Lustro fue desarrollada como una técnica de automatización de laboratorio diseñada para el cribado y caracterización de sistemas optogenéticos de alto rendimiento. Integra un lector de microplacas, un dispositivo de iluminación y un dispositivo de agitación con una estación de trabajo de automatización⁶. Lustro combina el cultivo automatizado y la estimulación lumínica de células en placas de micropocillos (Figura 1 y Figura 1 suplementaria), lo que permite el cribado y la comparación rápidos de diferentes sistemas optogenéticos. La plataforma Lustro es altamente adaptable y se puede generalizar para trabajar con otros robots de automatización de laboratorio, dispositivos de iluminación, lectores de placas, tipos de células y sistemas optogenéticos, incluidos aquellos que responden a diferentes longitudes de onda de luz.

Este protocolo demuestra la configuración y el uso de Lustro para caracterizar un sistema optogenético. El control optogenético de los factores de transcripción divididos en levaduras se utiliza como sistema de ejemplo para ilustrar la función y utilidad de la plataforma mediante el sondeo de la relación entre las entradas de luz y la expresión de un gen indicador fluorescente, mScarlet-I⁷. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden agilizar la optimización de los sistemas optogenéticos y acelerar el descubrimiento de nuevas estrategias para el control dinámico de los sistemas biológicos.

Protocolo

Las cepas de levadura utilizadas en este estudio están documentadas en la Tabla de Materiales. Estas cepas presentan un crecimiento robusto dentro del rango de temperatura de 22 °C a 30 °C y pueden cultivarse en varios medios de levadura estándar.

1. Configuración de la estación de trabajo de automatización

1. Equipe la estación de trabajo automatizada con un brazo de agarre robótico (RGA, consulte la tabla de materiales) capaz de mover placas de micropocillos (Figura 1).
2. Instale un agitador calentador de microplacas (consulte la Tabla de materiales) en la estación de trabajo automatizada (Figura 1(1)) con un mecanismo de bloqueo automático de placas que proporcione acceso RGA.
3. Coloque un lector de microplacas junto a la estación de trabajo automatizada (Figura 1(2)), asegurando la accesibilidad RGA.
4. Incorpore un dispositivo de iluminación de microplacas (Figura 1 (3)) que permita un acceso RGA conveniente. Algunos ejemplos son la optoPlate⁸ (como se utiliza en este estudio) o la LITOS⁹ (véase la tabla de materiales).

2. Preparación del dispositivo de iluminación

1. Construya y calibre la optoPlate (o dispositivo de iluminación alternativo) siguiendo los métodos establecidos 8,10,11.
2. Utilice un adaptador en el dispositivo de iluminación para habilitar el acceso RGA.
3. Programe la optoPlate utilizando una entrada de hoja de cálculo¹⁰ o una interfaz gráfica¹². Siga el paso 3 para ejecutar los programas de estimulación lumínica.

3. Diseñar un programa de estimulación lumínica

1. Determine las condiciones de luz deseadas para el experimento.
2. Introduzca las condiciones de luz deseadas, incluida la intensidad de la luz, el tiempo de inicio de la luz, la longitud del pulso, el número de pulsos y la duración entre pulsos, en una hoja de cálculo.
   NOTA: Actualice esta información en optoPlate siguiendo las instrucciones proporcionadas en el repositorio de GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Recuerde que la placa de muestra no se iluminará mientras esté en el lector de microplacas o en el agitador calentador. La duración y la frecuencia de estos eventos pueden requerir una optimización basada en requisitos experimentales específicos.
3. Incluya condiciones oscuras para cada cepa para permitir mediciones de fondo adecuadas.
4. Para los experimentos de caracterización iniciales para evaluar la funcionalidad del transformante, utilice una intensidad de luz alta.
   NOTA: La intensidad de la luz debe optimizarse para experimentos más sensibles, ya que el exceso de luz puede ser fototóxico para la levadura¹³.

4. Preparación del lector de microplacas

1. Configure el lector de microplacas para medir la cantidad deseada de interés antes de realizar experimentos.
   NOTA: En este ejemplo, el lector de microplacas se configuró para medir la fluorescencia de un reportero expresado por la cepa de interés. Se pueden utilizar otras salidas, como la luminiscencia o la densidad óptica, en función de los requisitos experimentales.
2. Cultive la cepa de interés (junto con un control no fluorescente) en medios sintéticos completos (SC)¹⁴ (u otro medio de baja fluorescencia) (consulte la Tabla de Materiales) hasta la densidad celular más alta que se va a medir. Transfiera los cultivos a una placa de micropocillos con fondo de vidrio y paredes negras (consulte la Tabla de materiales) y mídalos para determinar la configuración óptima del lector de microplacas.
   NOTA: Asegúrese de que las lecturas sean precisas ingresando correctamente las dimensiones de la placa y midiéndola desde abajo.
3. Consulte una base de datos de proteínas fluorescentes (por ejemplo, fpbase.org) para obtener espectros aproximados de absorción y emisión de la proteína fluorescente diana¹⁵.
4. Determine el valor z (distancia entre la placa y el lector) realizando un escaneo z en pocillos que contienen las cepas fluorescentes y no fluorescentes. Seleccione el valor z que produce la relación señal-ruido más alta.
5. Optimice los espectros de absorción y emisión mediante la realización de escaneos de absorción y emisión en las cepas fluorescentes y no fluorescentes para determinar la relación señal-ruido óptima.
6. Mida la deformación fluorescente con la ganancia ajustada al nivel óptimo, determinando la ganancia óptica más alta que se puede utilizar sin que se produzca un error de medición de desbordamiento.
   NOTA: Esta ganancia óptica debe ajustarse manualmente de forma coherente en todos los experimentos que impliquen la misma deformación para garantizar la coherencia de los resultados.
7. Prepare un script de medición (consulte la Figura 2) en el software del lector de microplacas. Este script configura el instrumento para medir la densidad óptica de los cultivos y los espectros de fluorescencia de cualquier proteína fluorescente que se vaya a medir.
   NOTA: Mida la densidad óptica de las cepas a 600 nm a menos que expresen proteínas fluorescentes rojas. Para cepas que expresan proteínas fluorescentes rojas, mida la densidad óptica a 700 nm para evitar el sesgo¹⁶.
8. Ajuste el guión de medición para mantener una temperatura de incubación interna de 30 °C durante las mediciones.
9. Configure el script de medición para exportar los datos a una hoja de cálculo o archivos ASCII, según sus preferencias.

5. Programación del robot

1. Configure la definición de la mesa de trabajo en el software de la estación de trabajo automatizada en función de la disposición física de los portadores (p. ej., agitadores de calentadores, plataformas de anidación, dispositivos de iluminación) y el material de laboratorio (es decir, la placa de 96 pocillos) (consulte la Tabla de materiales). Cree un script en el software de la estación de trabajo de automatización para ejecutar la inducción de luz y las mediciones (Figura 3), siguiendo los pasos a continuación.
2. Desactive cualquier fuente de iluminación interna para evitar la activación en segundo plano de los sistemas optogenéticos.
3. Ajuste el agitador del calentador para mantener una temperatura de 30 °C. Cuando la placa no está en el agitador del calentador, estará a temperatura ambiente (22 °C).
4. Utilice bucles, un temporizador y una variable de conteo de bucles para repetir los pasos de inducción y medición de las celdas a intervalos regulares.
5. Antes de registrar las mediciones, agite la placa de muestra para asegurar la suspensión adecuada de todas las células. Una agitación de 60 s a 1.000 rpm con un orbital de 2 mm es generalmente suficiente para resuspender las células de S. cerevisiae S288C y evitar el sesgo de medición.
6. Mueva la placa de muestra al lector de microplacas con el brazo robótico y retire la tapa (si corresponde) para evitar sesgos en la medición de la densidad óptica. El software de control retirará y volverá a colocar automáticamente la tapa en la posición designada si la definición del portador del lector de microplacas está configurada para no permitir tapas.
7. Ejecute el script de medición del lector de microplacas como se describe en el paso 4.
8. Vuelva a colocar la tapa de la placa de muestra y mueva la placa hacia el dispositivo de iluminación con el brazo robótico.
9. Configure el script para esperar hasta que el temporizador alcance el intervalo de tiempo especificado (por ejemplo, 30 minutos multiplicados por la variable de recuento de bucles) y, a continuación, repita todo el bucle para el número deseado de iteraciones (por ejemplo, 48 veces para un experimento de 24 horas).
10. Solucione posibles errores y garantice el correcto funcionamiento de las definiciones del soporte y del material de laboratorio, así como la capacidad del RGA para recoger y colocar con precisión la placa pasando una placa vacía a través del bucle de script varias veces.
11. Configure alertas de usuario para notificar al usuario de cualquier cambio de estado del instrumento o error que pueda ocurrir durante la ejecución del protocolo.

6. Configuración de la placa de muestra

1. Cultive cepas de levadura en placas de medios enriquecidos, como el agar YPD¹⁷ (consulte la Tabla de materiales). Incluya un control no fluorescente (negativo).
2. Seleccione las colonias de las placas e inoculelas en 3 mL de medio SC¹⁴ (u otro medio de baja fluorescencia, como LFM¹⁸) en tubos de cultivo de vidrio. Incubar los cultivos durante la noche a 30 °C en un tambor de rodillos mientras se mantienen en la oscuridad o en condiciones de luz que no responden (por ejemplo, luz roja para sistemas que responden a la luz azul).
3. Mida la densidad óptica de los cultivos durante la noche diluyendo 200 μL de cada cultivo en 1 ml de medio SC y registrando la densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro o un lector de microplacas.
4. Diluir cada cultivo durante la noche a un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,1 en tubos de cultivo de vidrio. Para pruebas de deformación de mayor rendimiento, realice diluciones automatizadas en placas de micropocillos.
5. Pipetear los cultivos diluidos en la placa de 96 pocillos. Incluya pozos triplicados para cada condición (es decir, tres pozos idénticos con la misma deformación y condición de luz) para tener en cuenta la variación técnica. Incluya pocillos con medios en blanco y celdas no fluorescentes como controles negativos para medir la fluorescencia de fondo y la densidad óptica.
6. Incubar la placa a 30 °C agitándola durante 5 h antes de comenzar el experimento de inducción de luz. Ajuste las cantidades de dilución y los tiempos de incubación según sea necesario para optimizar las cepas específicas y las condiciones experimentales.

7. Realización del experimento

1. Coloque la placa de muestra en el agitador del calentador e inicie el script de automatización como se describe en el paso 5.
2. Comience el programa de estimulación lumínica como se describe en el paso 3 una vez que se haya registrado la medición inicial en el lector de placas.
3. Si la estación de trabajo de automatización no está en una habitación oscura, cúbrala con una cortina opaca para evitar la iluminación de fondo.

8. Análisis de datos

1. Cree un mapa de hoja de cálculo para el experimento, que refleje el diseño de 8 x 12 de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el mapa incluya los nombres de las deformaciones que se miden en una cuadrícula y descripciones de las condiciones de luz utilizadas en otra cuadrícula.
2. Utilice un script de Python u otro lenguaje de programación preferido para analizar los datos exportados. Importe la hoja de cálculo del mapa en una matriz, asociando los nombres de las cepas y los nombres de las condiciones con cada pocillo de la placa.
   NOTA: El código de muestra para el análisis se puede encontrar en: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativamente, se puede emplear una aplicación para analizar los datos de varios lectores de placas¹⁹.
3. Lea los datos de la hoja de cálculo del experimento exportado en otra matriz.
4. Genere gráficos de los valores de densidad óptica y los valores de fluorescencia para cada cepa y condición a lo largo del tiempo, como se ilustra en la Figura 4.
5. Examinar las gráficas de densidad óptica para determinar las etapas de crecimiento exponencial o saturación en los cultivos. Esta información ayudará a seleccionar los puntos de tiempo apropiados para comparar las mediciones de fluorescencia entre cepas o condiciones, como se muestra en la Figura 5.

Resultados

La Figura 4A muestra los valores de fluorescencia a lo largo del tiempo para una cepa optogenética que expresa un reportero fluorescente controlado por un factor de transcripción dividida inducible por luz. Las diferentes condiciones de luz utilizadas en el experimento se reflejan en las variaciones en el ciclo de trabajo, que representa el porcentaje de tiempo que la luz está encendida. Se observa que el nivel general de fluorescencia es proporcional al ciclo de trabajo de la estimulaci?...

Discusión

El protocolo Lustro presentado aquí automatiza los procesos de cultivo, iluminación y medición, lo que permite el cribado y la caracterización de sistemas optogenéticos de alto rendimiento⁶. Esto se logra mediante la integración de un dispositivo de iluminación, un lector de microplacas y un dispositivo de agitación en una estación de trabajo de automatización. Este protocolo demuestra específicamente la utilidad de Lustro para el cribado de diferentes constructos optogenéticos integra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500