Experimentos de optogenética de alto rendimiento en levaduras utilizando la plataforma automatizada Lustro

Resumen

Este protocolo describe los pasos para utilizar la plataforma automatizada Lustro para realizar una caracterización de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos en levaduras.

Resumen

La optogenética ofrece un control preciso sobre el comportamiento celular mediante la utilización de proteínas sensibles a la luz codificadas genéticamente. Sin embargo, la optimización de estos sistemas para lograr la funcionalidad deseada a menudo requiere múltiples ciclos de diseño, construcción y prueba, que pueden llevar mucho tiempo y mano de obra. Para hacer frente a este reto, hemos desarrollado Lustro, una plataforma que combina la estimulación lumínica con la automatización del laboratorio, lo que permite un cribado y caracterización eficientes de alto rendimiento de los sistemas optogenéticos.

Lustro utiliza una estación de trabajo de automatización equipada con un dispositivo de iluminación, un dispositivo de agitación y un lector de placas. Mediante el empleo de un brazo robótico, Lustro automatiza el movimiento de una placa de micropocillos entre estos dispositivos, lo que permite la estimulación de cepas optogenéticas y la medición de su respuesta. Este protocolo proporciona una guía paso a paso sobre el uso de Lustro para caracterizar los sistemas optogenéticos para el control de la expresión génica en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. El protocolo cubre la configuración de los componentes de Lustro, incluida la integración del dispositivo de iluminación con la estación de trabajo de automatización. También proporciona instrucciones detalladas para programar el dispositivo de iluminación, el lector de placas y el robot, lo que garantiza un funcionamiento fluido y la adquisición de datos durante todo el proceso experimental.

Introducción

La optogenética es una técnica poderosa que utiliza proteínas sensibles a la luz para controlar el comportamiento de las células con alta precisión ^1,2,3. Sin embargo, la creación de prototipos de construcciones optogenéticas y la identificación de las condiciones óptimas de iluminación pueden llevar mucho tiempo, lo que dificulta la optimización de los sistemas optogenéticos ^4,5. Los métodos de alto rendimiento para detectar y caracterizar rápidamente la actividad de los sistemas optogenéticos pueden acelerar el cicl....

Protocolo

Las cepas de levadura utilizadas en este estudio están documentadas en la Tabla de Materiales. Estas cepas presentan un crecimiento robusto dentro del rango de temperatura de 22 °C a 30 °C y pueden cultivarse en varios medios de levadura estándar.

1. Configuración de la estación de trabajo de automatización

1. Equipe la estación de trabajo automatizada con un brazo de agarre robótico (RGA, consulte la tabla de materiales) capaz de mover placas de micropocillos (Figura 1).
2. Instale un agitador calentador de microplacas (consulte ....

Discusión

El protocolo Lustro presentado aquí automatiza los procesos de cultivo, iluminación y medición, lo que permite el cribado y la caracterización de sistemas optogenéticos de alto rendimiento⁶. Esto se logra mediante la integración de un dispositivo de iluminación, un lector de microplacas y un dispositivo de agitación en una estación de trabajo de automatización. Este protocolo demuestra específicamente la utilidad de Lustro para el cribado de diferentes constructos optogenéticos integra.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500