Expériences d’optogénétique à haut débit dans la levure à l’aide de la plateforme automatisée Lustro

Résumé

Ce protocole décrit les étapes de l’utilisation de la plate-forme automatisée Lustro pour effectuer une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques chez la levure.

Résumé

L’optogénétique offre un contrôle précis du comportement cellulaire en utilisant des protéines sensibles à la lumière codées génétiquement. Cependant, l’optimisation de ces systèmes pour obtenir les fonctionnalités souhaitées nécessite souvent plusieurs cycles de conception, de construction et de test, ce qui peut prendre beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Pour relever ce défi, nous avons développé Lustro, une plateforme qui combine la stimulation lumineuse avec l’automatisation du laboratoire, permettant un criblage et une caractérisation efficaces à haut débit des systèmes optogénétiques.

Lustro utilise un poste de travail d’automatisation équipé d’un dispositif d’éclairage, d’un dispositif d’agitation et d’un lecteur de plaques. En utilisant un bras robotisé, Lustro automatise le mouvement d’une plaque de micropuits entre ces dispositifs, ce qui permet de stimuler les souches optogénétiques et de mesurer leur réponse. Ce protocole fournit un guide étape par étape sur l’utilisation de Lustro pour caractériser les systèmes optogénétiques pour le contrôle de l’expression génique chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae. Le protocole couvre la configuration des composants de Lustro, y compris l’intégration du dispositif d’éclairage avec le poste de travail d’automatisation. Il fournit également des instructions détaillées pour la programmation du dispositif d’éclairage, du lecteur de plaques et du robot, garantissant un fonctionnement fluide et l’acquisition de données tout au long du processus expérimental.

Introduction

L’optogénétique est une technique puissante qui utilise des protéines sensibles à la lumière pour contrôler le comportement des cellules avec une grande précision ^1,2,3. Cependant, le prototypage de constructions optogénétiques et l’identification des conditions d’éclairage optimales peuvent prendre beaucoup de temps, ce qui rend difficile l’optimisation des systèmes optogénétiques ^4,5. Des méthodes à haut débit permettant de cribler et de caractériser rapidement l’activité des systèmes optogénétiques peuvent accélére....

Protocole

Les souches de levure utilisées dans cette étude sont documentées dans le tableau des matériaux. Ces souches présentent une croissance robuste dans la plage de température de 22 °C à 30 °C et peuvent être cultivées dans divers milieux de levure standard.

1. Mise en place du poste de travail d’automatisation

1. Équiper le poste de travail automatisé d’un bras de préhension robotisé (RGA, voir le tableau des matériaux) capable de déplacer des plaques de micropuits (Figure 1).
2. Installer un agitateur chauffant pour microplaques (voir le tab....

Discussion

Le protocole Lustro présenté ici automatise les processus de culture, d’éclairage et de mesure, permettant un criblage et une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques⁶. Ceci est réalisé en intégrant un dispositif d’éclairage, un lecteur de microplaques et un dispositif d’agitation dans un poste de travail d’automatisation. Ce protocole démontre spécifiquement l’utilité de Lustro pour le criblage de différentes constructions optogénétiques intégrées da.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500