Expériences d’optogénétique à haut débit dans la levure à l’aide de la plateforme automatisée Lustro

Résumé

Ce protocole décrit les étapes de l’utilisation de la plate-forme automatisée Lustro pour effectuer une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques chez la levure.

Résumé

L’optogénétique offre un contrôle précis du comportement cellulaire en utilisant des protéines sensibles à la lumière codées génétiquement. Cependant, l’optimisation de ces systèmes pour obtenir les fonctionnalités souhaitées nécessite souvent plusieurs cycles de conception, de construction et de test, ce qui peut prendre beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Pour relever ce défi, nous avons développé Lustro, une plateforme qui combine la stimulation lumineuse avec l’automatisation du laboratoire, permettant un criblage et une caractérisation efficaces à haut débit des systèmes optogénétiques.

Lustro utilise un poste de travail d’automatisation équipé d’un dispositif d’éclairage, d’un dispositif d’agitation et d’un lecteur de plaques. En utilisant un bras robotisé, Lustro automatise le mouvement d’une plaque de micropuits entre ces dispositifs, ce qui permet de stimuler les souches optogénétiques et de mesurer leur réponse. Ce protocole fournit un guide étape par étape sur l’utilisation de Lustro pour caractériser les systèmes optogénétiques pour le contrôle de l’expression génique chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae. Le protocole couvre la configuration des composants de Lustro, y compris l’intégration du dispositif d’éclairage avec le poste de travail d’automatisation. Il fournit également des instructions détaillées pour la programmation du dispositif d’éclairage, du lecteur de plaques et du robot, garantissant un fonctionnement fluide et l’acquisition de données tout au long du processus expérimental.

Introduction

L’optogénétique est une technique puissante qui utilise des protéines sensibles à la lumière pour contrôler le comportement des cellules avec une grande précision ^1,2,3. Cependant, le prototypage de constructions optogénétiques et l’identification des conditions d’éclairage optimales peuvent prendre beaucoup de temps, ce qui rend difficile l’optimisation des systèmes optogénétiques ^4,5. Des méthodes à haut débit permettant de cribler et de caractériser rapidement l’activité des systèmes optogénétiques peuvent accélérer le cycle conception-construction-test pour le prototypage des constructions et l’exploration de leur fonction.

La plate-forme Lustro a été développée en tant que technique d’automatisation de laboratoire conçue pour le criblage et la caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques. Il intègre un lecteur de microplaques, un dispositif d’éclairage et un dispositif d’agitation avec un poste de travail d’automatisation⁶. Lustro combine la culture automatisée et la stimulation par la lumière des cellules dans des plaques de micropuits (Figure 1 et Figure supplémentaire 1), ce qui permet le criblage et la comparaison rapides de différents systèmes optogénétiques. La plate-forme Lustro est hautement adaptable et peut être généralisée pour fonctionner avec d’autres robots d’automatisation de laboratoire, des dispositifs d’éclairage, des lecteurs de plaques, des types de cellules et des systèmes optogénétiques, y compris ceux qui répondent à différentes longueurs d’onde de la lumière.

Ce protocole démontre la configuration et l’utilisation de Lustro pour caractériser un système optogénétique. Le contrôle optogénétique des facteurs de transcription fractionnés chez la levure est utilisé comme exemple de système pour illustrer la fonction et l’utilité de la plate-forme en sondant la relation entre les entrées lumineuses et l’expression d’un gène rapporteur fluorescent, mScarlet-I⁷. En suivant ce protocole, les chercheurs peuvent rationaliser l’optimisation des systèmes optogénétiques et accélérer la découverte de nouvelles stratégies pour le contrôle dynamique des systèmes biologiques.

Protocole

Les souches de levure utilisées dans cette étude sont documentées dans le tableau des matériaux. Ces souches présentent une croissance robuste dans la plage de température de 22 °C à 30 °C et peuvent être cultivées dans divers milieux de levure standard.

1. Mise en place du poste de travail d’automatisation

1. Équiper le poste de travail automatisé d’un bras de préhension robotisé (RGA, voir le tableau des matériaux) capable de déplacer des plaques de micropuits (Figure 1).
2. Installer un agitateur chauffant pour microplaques (voir le tableau des matériaux) dans le poste de travail automatisé (figure 1(1)) avec un mécanisme de verrouillage automatique de la plaque qui permet l’accès au RGA.
3. Placer un lecteur de microplaques à côté du poste de travail automatisé (figure 1(2)), en assurant l’accessibilité du RGA.
4. Incorporer un dispositif d’éclairage de microplaque (Figure 1(3)) qui permet un accès pratique au RGA. C’est le cas, par exemple, de l’optoPlate⁸ (tel qu’il est utilisé dans cette étude) ou du LITOS⁹ (voir le tableau des matériaux).

2. Préparation du dispositif d’éclairage

1. Construire et calibrer l’optoPlate (ou un autre dispositif d’éclairage) en suivant les méthodes établies 8,10,11.
2. Utilisez un adaptateur sur le dispositif d’éclairage pour activer l’accès RGA.
3. Programmez l’optoPlate à l’aide d’une entrée de tableur¹⁰ ou d’une interface graphique¹². Suivez l’étape 3 pour exécuter les programmes de stimulation lumineuse.

3. Concevoir un programme de stimulation lumineuse

1. Déterminez les conditions d’éclairage souhaitées pour l’expérience.
2. Entrez les conditions d’éclairage souhaitées, y compris l’intensité lumineuse, l’heure de début de la lumière, la longueur d’impulsion, le nombre d’impulsions et la durée d’inter-impulsion, dans une feuille de calcul.
   REMARQUE : Flashez ces informations sur l’optoPlate en suivant les instructions fournies dans le référentiel GitHub : github.com/mccleanlab/Optoplate-96. N’oubliez pas que la plaque d’échantillon ne sera pas allumée lorsqu’elle sera dans le lecteur de microplaques ou sur l’agitateur de chauffage. La durée et la fréquence de ces événements peuvent nécessiter une optimisation en fonction d’exigences expérimentales spécifiques.
3. Incluez des conditions d’obscurité pour chaque souche afin de permettre des mesures de fond appropriées.
4. Pour les expériences de caractérisation initiales visant à évaluer la fonctionnalité des transformants, utilisez une intensité lumineuse élevée.
   REMARQUE : L’intensité lumineuse doit être optimisée pour les expériences plus sensibles, car une lumière excessive peut être phototoxique pour la levure¹³.

4. Préparation du lecteur de microplaques

1. Configurez le lecteur de microplaques pour mesurer la quantité d’intérêt souhaitée avant de mener des expériences.
   REMARQUE : Dans cet exemple, le lecteur de microplaques a été configuré pour mesurer la fluorescence d’un rapporteur exprimée par la souche d’intérêt. D’autres sorties, telles que la luminescence ou la densité optique, peuvent être utilisées en fonction des exigences expérimentales.
2. Cultiver la souche d’intérêt (avec un témoin non fluorescent) dans un milieu synthétique complet (SC)¹⁴ (ou un autre milieu à faible fluorescence) (voir le tableau des matériaux) jusqu’à la densité cellulaire la plus élevée à mesurer. Transférez les cultures dans une plaque de micropuits à fond de verre à paroi noire (voir le tableau des matériaux) et mesurez-les pour déterminer les réglages optimaux du lecteur de microplaques.
   REMARQUE : Assurez-vous que les lectures sont exactes en saisissant correctement les dimensions de la plaque et en mesurant la plaque par le bas.
3. Reportez-vous à une base de données sur les protéines fluorescentes (par exemple, fpbase.org) pour obtenir des spectres approximatifs d’absorption et d’émission pour la protéine fluorescente cible¹⁵.
4. Déterminez la valeur z (distance entre la plaque et le lecteur) en effectuant un balayage z sur les puits contenant les souches fluorescentes et non fluorescentes. Sélectionnez la valeur z qui donne le rapport signal/bruit le plus élevé.
5. Optimisez les spectres d’absorption et d’émission en effectuant des balayages d’absorption et d’émission sur les souches fluorescentes et non fluorescentes afin de déterminer le rapport signal/bruit optimal.
6. Mesurez la contrainte fluorescente avec le gain réglé sur le niveau optimal, en déterminant le gain optique le plus élevé qui peut être utilisé sans entraîner d’erreur de mesure de débordement.
   REMARQUE : Ce gain optique doit être réglé manuellement de manière cohérente dans les expériences impliquant la même déformation afin d’assurer la cohérence des résultats.
7. Préparez un script de mesure (reportez-vous à la figure 2) dans le logiciel de lecture des microplaques. Ce script configure l’instrument pour mesurer la densité optique des cultures et les spectres de fluorescence de toutes les protéines fluorescentes à mesurer.
   REMARQUE : Mesurez la densité optique des souches à 600 nm, à moins qu’elles n’expriment des protéines fluorescentes rouges. Pour les souches exprimant des protéines fluorescentes rouges, mesurez la densité optique à 700 nm pour éviter le biais¹⁶.
8. Réglez le script de mesure pour maintenir une température d’incubation interne de 30 °C pendant les mesures.
9. Configurez le script de mesure pour exporter les données dans une feuille de calcul ou des fichiers ASCII, selon vos préférences.

5. Programmation du robot

1. Configurez la définition de la table de travail dans le logiciel du poste de travail automatisé en fonction de la disposition physique des supports (p. ex., agitateurs chauffants, plates-formes de nidification, dispositifs d’éclairage) et du matériel de laboratoire (p. ex., la plaque à 96 puits) (voir le tableau des matériaux). Créez un script dans le logiciel de la station de travail d’automatisation pour exécuter l’induction de lumière et les mesures (Figure 3), en suivant les étapes ci-dessous.
2. Désactivez toutes les sources d’éclairage internes pour empêcher l’activation en arrière-plan des systèmes optogénétiques.
3. Réglez l’agitateur chauffant pour qu’il maintienne une température de 30 °C. Lorsque la plaque n’est pas sur le vibreur chauffant, elle sera à température ambiante (22 °C).
4. Utilisez des boucles, une minuterie et une variable de comptage de boucles pour répéter les étapes d’induction et de mesure des cellules à intervalles réguliers.
5. Avant d’enregistrer les mesures, agitez la plaque d’échantillon pour assurer une suspension correcte de toutes les cellules. Une secousse de 60 s à 1 000 tr/min avec une orbitale de 2 mm est généralement suffisante pour remettre en suspension les cellules S288C S. cerevisiae et éviter les biais de mesure.
6. Déplacez la plaque d’échantillon vers le lecteur de microplaques à l’aide du bras du robot et retirez le couvercle (le cas échéant) pour éviter tout biais lors de la mesure de la densité optique. Le logiciel de contrôle retirera et replacera automatiquement le couvercle dans la position désignée si la définition du support du lecteur de microplaques est réglée pour ne pas autoriser les couvercles.
7. Exécutez le script de mesure du lecteur de microplaques comme décrit à l’étape 4.
8. Replacez le couvercle de la plaque d’échantillon et déplacez la plaque vers le dispositif d’éclairage à l’aide du bras du robot.
9. Réglez le script pour qu’il attende que le minuteur atteigne l’intervalle de temps spécifié (par exemple, 30 min multiplié par la variable de comptage de boucles), puis répétez la boucle entière pour le nombre d’itérations souhaité (par exemple, 48 fois pour une expérience de 24 h).
10. Résolvez les erreurs potentielles et assurez-vous du bon fonctionnement des définitions du support et du matériel de laboratoire, ainsi que de la capacité du RGA à saisir et à placer avec précision la plaque en faisant passer une plaque vide dans la boucle de script plusieurs fois.
11. Configurez les alertes utilisateur pour avertir l’utilisateur de tout changement d’état de l’instrument ou de toute erreur pouvant survenir pendant l’exécution du protocole.

6. Mise en place de la plaque d’échantillon

1. Cultivez des souches de levure sur des plaques de milieux riches, telles que la gélose YPD¹⁷ (voir le tableau des matériaux). Inclure une commande non fluorescente (négative).
2. Sélectionner les colonies dans les plaques et les inoculer dans 3 mL de milieu SC¹⁴ (ou un autre milieu à faible fluorescence, tel que LFM¹⁸) dans des tubes de culture en verre. Incuber les cultures pendant la nuit à 30 °C sur un tambour à rouleaux tout en les gardant dans l’obscurité ou dans des conditions de lumière non réactive (par exemple, lumière rouge pour les systèmes sensibles à la lumière bleue).
3. Mesurer la densité optique des cultures de nuit en diluant 200 μL de chaque culture dans 1 mL de milieu SC et en enregistrant la densité optique à 600 nm (OD600) à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de microplaques.
4. Diluer chaque culture pendant la nuit à un OD₆₀₀ de 0,1 dans des tubes de culture en verre. Pour des essais de déformation à débit plus élevé, effectuez des dilutions automatisées dans des plaques de micropuits.
5. Pipeter les cultures diluées dans la plaque à 96 puits. Inclure des puits triples pour chaque condition (c.-à-d. trois puits identiques avec la même déformation et la même condition de lumière) pour tenir compte des variations techniques. Inclure des puits avec des milieux vierges et des cellules non fluorescentes comme témoins négatifs pour mesurer la fluorescence de fond et la densité optique.
6. Incuber la plaque à 30 °C en agitant pendant 5 h avant de commencer l’expérience d’induction lumineuse. Ajustez les quantités de dilution et les temps d’incubation si nécessaire pour optimiser en fonction de souches et de conditions expérimentales spécifiques.

7. Réalisation de l’expérience

1. Placez la plaque d’échantillon sur l’agitateur de chauffage et lancez le script d’automatisation comme indiqué à l’étape 5.
2. Commencez le programme de stimulation lumineuse comme décrit à l’étape 3 une fois que la mesure initiale sur le lecteur de plaque a été enregistrée.
3. Si le poste de travail d’automatisation ne se trouve pas dans une pièce sombre, couvrez-le d’un rideau occultant pour éviter l’éclairage de fond.

8. Analyse des données

1. Créez une feuille de calcul pour l’expérience, reflétant la disposition 8 x 12 de la plaque à 96 puits. Assurez-vous que la carte inclut les noms des déformations mesurées dans une grille et des descriptions des conditions d’éclairage utilisées dans une autre grille.
2. Utilisez un script Python ou un autre langage de programmation préféré pour analyser les données exportées. Importez la feuille de calcul de la carte dans un tableau, en associant les noms de déformation et les noms de condition à chaque puits de la plaque.
   REMARQUE : Un exemple de code pour l’analyse est disponible à l’adresse suivante : https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativement, on peut utiliser une application pour analyser les données de divers lecteurs de plaques¹⁹.
3. Lisez les données de la feuille de calcul de l’expérience exportée dans un autre tableau.
4. Générez des graphiques des valeurs de densité optique et des valeurs de fluorescence pour chaque déformation et condition au fil du temps, comme illustré à la figure 4.
5. Examinez les diagrammes de densité optique pour déterminer les stades de croissance exponentielle ou de saturation dans les cultures. Cette information aidera à choisir des points de temps appropriés pour comparer les mesures de fluorescence entre les souches ou les conditions, comme le montre la figure 5.

Résultats

La figure 4A montre les valeurs de fluorescence au cours du temps pour une souche optogénétique exprimant un rapporteur fluorescent contrôlé par un facteur de transcription fractionné inductible par la lumière. Les différentes conditions d’éclairage utilisées dans l’expérience sont reflétées par des variations dans le cycle de service, qui représente le pourcentage de temps pendant lequel la lumière est allumée. On observe que le niveau de fluorescence global est proportio...

Discussion

Le protocole Lustro présenté ici automatise les processus de culture, d’éclairage et de mesure, permettant un criblage et une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques⁶. Ceci est réalisé en intégrant un dispositif d’éclairage, un lecteur de microplaques et un dispositif d’agitation dans un poste de travail d’automatisation. Ce protocole démontre spécifiquement l’utilité de Lustro pour le criblage de différentes constructions optogénétiques intégrées da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500