Hochdurchsatz-Optogenetik-Experimente in Hefe mit der automatisierten Plattform Lustro

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Verwendung der automatisierten Plattform Lustro zur Durchführung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung optogenetischer Systeme in Hefe.

Zusammenfassung

Die Optogenetik bietet eine präzise Kontrolle des zellulären Verhaltens durch die Verwendung genetisch kodierter lichtempfindlicher Proteine. Die Optimierung dieser Systeme, um die gewünschte Funktionalität zu erreichen, erfordert jedoch oft mehrere Design-Build-Test-Zyklen, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein können. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir Lustro entwickelt, eine Plattform, die Lichtstimulation mit Laborautomatisierung kombiniert und so ein effizientes Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme ermöglicht.

Lustro verfügt über einen Automationsarbeitsplatz, der mit einer Beleuchtungsvorrichtung, einer Schüttelvorrichtung und einem Plattenleser ausgestattet ist. Durch den Einsatz eines Roboterarms automatisiert Lustro die Bewegung einer Mikrotiterplatte zwischen diesen Geräten und ermöglicht so die Stimulation optogenetischer Stämme und die Messung ihrer Reaktion. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von Lustro zur Charakterisierung optogenetischer Systeme zur Genexpressionskontrolle in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Protokoll umfasst die Einrichtung der Lustro-Komponenten, einschließlich der Integration des Beleuchtungsgeräts in die Automatisierungsstation. Es enthält auch detaillierte Anweisungen für die Programmierung des Beleuchtungsgeräts, des Plattenlesers und des Roboters, um einen reibungslosen Betrieb und eine reibungslose Datenerfassung während des gesamten Versuchsprozesses zu gewährleisten.

Einleitung

Die Optogenetik ist eine leistungsfähige Technik, die lichtempfindliche Proteine nutzt, um das Verhalten von Zellen mit hoher Präzision zu steuern ^1,2,3. Das Prototyping optogenetischer Konstrukte und die Identifizierung optimaler Beleuchtungsbedingungen können jedoch zeitaufwändig sein, was die Optimierung optogenetischer Systeme erschwert ^4,5. Hochdurchsatzmethoden zum schnellen Screening und zur Charakterisierung der Aktivität optogenetischer Systeme können den Design-Build-Test-Zyklus für das Prototyping von Konstrukten und die Erforschung ihrer Funktion beschleunigen.

Die Lustro-Plattform wurde als Laborautomatisierungstechnik für das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme entwickelt. Es integriert einen Mikroplatten-Reader, eine Beleuchtungsvorrichtung und eine Schüttelvorrichtung mit einer Automatisierungs-Workstation⁶. Lustro kombiniert die automatisierte Kultivierung und Lichtstimulation von Zellen in Mikrotiterplatten (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1) und ermöglicht so das schnelle Screening und den Vergleich verschiedener optogenetischer Systeme. Die Lustro-Plattform ist hochgradig anpassungsfähig und kann verallgemeinert werden, um mit anderen Laborautomatisierungsrobotern, Beleuchtungsgeräten, Plattenlesegeräten, Zelltypen und optogenetischen Systemen zu arbeiten, einschließlich solcher, die auf verschiedene Wellenlängen des Lichts reagieren.

Dieses Protokoll demonstriert den Aufbau und die Verwendung von Lustro zur Charakterisierung eines optogenetischen Systems. Die optogenetische Kontrolle von gespaltenen Transkriptionsfaktoren in Hefe wird als Beispielsystem verwendet, um die Funktion und den Nutzen der Plattform zu veranschaulichen, indem die Beziehung zwischen Lichteinträgen und der Expression eines fluoreszierenden Reportergens, mScarlet-I⁷, untersucht wird. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher die Optimierung optogenetischer Systeme rationalisieren und die Entdeckung neuer Strategien für die dynamische Steuerung biologischer Systeme beschleunigen.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Hefestämme sind in der Materialtabelle dokumentiert. Diese Stämme weisen ein robustes Wachstum im Temperaturbereich von 22 °C bis 30 °C auf und können in verschiedenen Standardhefemedien kultiviert werden.

1. Einrichten des Automationsarbeitsplatzes

1. Statten Sie die automatisierte Workstation mit einem Roboter-Greifarm (RGA, siehe Materialtabelle) aus, der in der Lage ist, Mikrotiterplatten zu bewegen (Abbildung 1).
2. Installieren Sie einen Mikroplatten-Heizschüttler (siehe Materialtabelle) in der automatisierten Workstation (Abbildung 1(1)) mit einem automatischen Plattenverriegelungsmechanismus, der RGA-Zugriff ermöglicht.
3. Positionieren Sie einen Mikroplatten-Reader neben der automatisierten Workstation (Abbildung 1(2)) und stellen Sie sicher, dass der RGA zugänglich ist.
4. Integrieren Sie ein Mikroplatten-Beleuchtungsgerät (Abbildung 1(3)), das einen bequemen RGA-Zugriff ermöglicht. Beispiele hierfür sind die optoPlate⁸ (wie sie in dieser Studie verwendet wird) oder LITOS⁹ (siehe Materialtabelle).

2. Vorbereitung des Beleuchtungsgerätes

1. Konstruieren und kalibrieren Sie die OptoPlate (oder ein alternatives Beleuchtungsgerät) nach den etablierten Methoden 8,10,11.
2. Verwenden Sie einen Adapter am Beleuchtungsgerät, um den RGA-Zugriff zu ermöglichen.
3. Programmieren Sie die optoPlate mit Hilfe einer Tabellenkalkulationseingabe¹⁰ oder einer grafischen Oberfläche¹². Befolgen Sie Schritt 3, um die Lichtstimulationsprogramme auszuführen.

3. Entwerfen eines Lichtstimulationsprogramms

1. Bestimmen Sie die gewünschten Lichtverhältnisse für das Experiment.
2. Geben Sie die gewünschten Lichtbedingungen, einschließlich Lichtintensität, Lichtstartzeit, Impulslänge, Impulszahl und Interpulsdauer, in eine Tabelle ein.
   HINWEIS: Flashen Sie diese Informationen auf die optoPlate, indem Sie die Anweisungen im GitHub-Repository befolgen: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Denken Sie daran, dass die Probenplatte nicht beleuchtet wird, während sie sich im Mikroplatten-Lesegerät oder auf dem Heizschüttler befindet. Die Dauer und Häufigkeit dieser Ereignisse kann eine Optimierung auf der Grundlage spezifischer experimenteller Anforderungen erfordern.
3. Beziehen Sie dunkle Bedingungen für jede Sorte mit ein, um korrekte Hintergrundmessungen zu ermöglichen.
4. Verwenden Sie für erste Charakterisierungsexperimente zur Beurteilung der Transformantenfunktionalität eine hohe Lichtintensität.
   HINWEIS: Die Lichtintensität sollte für empfindlichere Experimente optimiert werden, da übermäßiges Licht für Hefe¹³ phototoxisch sein kann.

4. Vorbereitung des Mikroplatten-Readers

1. Konfigurieren Sie den Mikroplatten-Reader so, dass er die gewünschte gewünschte Menge von Interesse misst, bevor Sie Experimente durchführen.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde der Mikroplatten-Reader so konfiguriert, dass er die Fluoreszenz eines Reporters misst, die durch den interessierenden Stamm ausgedrückt wird. Andere Leistungen, wie Lumineszenz oder optische Dichte, können je nach experimentellen Anforderungen verwendet werden.
2. Kultivieren Sie den interessierenden Stamm (zusammen mit einer nichtfluoreszierenden Kontrolle) in synthetischen vollständigen (SC) Medien¹⁴ (oder einem anderen Medium mit niedriger Fluoreszenz) (siehe Materialtabelle) bis zur höchsten zu messenden Zelldichte. Übertragen Sie die Kulturen in eine schwarzwandige Mikrotiterplatte mit Glasboden (siehe Materialtabelle) und messen Sie sie, um die optimalen Einstellungen für den Mikroplatten-Reader zu bestimmen.
   HINWEIS: Stellen Sie genaue Messwerte sicher, indem Sie die Plattenabmessungen korrekt eingeben und die Platte von unten messen.
3. Beziehen Sie sich auf eine fluoreszierende Proteindatenbank (z. B. fpbase.org), um ungefähre Absorptions- und Emissionsspektren für das fluoreszierende Zielprotein¹⁵ zu erhalten.
4. Bestimmen Sie den z-Wert (Abstand zwischen der Platte und dem Lesegerät), indem Sie einen z-Scan an Wells durchführen, die die fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Stämme enthalten. Wählen Sie den Z-Wert aus, der das höchste Signal-Rausch-Verhältnis ergibt.
5. Optimieren Sie die Absorptions- und Emissionsspektren, indem Sie Absorptions- und Emissionsscans an den fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Stämmen durchführen, um das optimale Signal-Rausch-Verhältnis zu bestimmen.
6. Messen Sie die fluoreszierende Dehnung mit der optimalen Verstärkung, um die höchste optische Verstärkung zu bestimmen, die verwendet werden kann, ohne dass es zu einem Überlaufmessfehler kommt.
   HINWEIS: Diese optische Verstärkung sollte bei Experimenten mit demselben Stamm manuell einheitlich eingestellt werden, um die Konsistenz der Ergebnisse zu gewährleisten.
7. Bereiten Sie ein Messskript (siehe Abbildung 2) in der Mikroplatten-Reader-Software vor. Mit diesem Skript wird das Gerät so konfiguriert, dass es die optische Dichte der Kulturen und die Fluoreszenzspektren aller zu messenden fluoreszierenden Proteine misst.
   HINWEIS: Messen Sie die optische Dichte von Stämmen bei 600 nm, es sei denn, sie exprimieren rot fluoreszierende Proteine. Bei Stämmen, die rot fluoreszierende Proteine exprimieren, ist die optische Dichte bei 700 nm zu messen, um Verzerrungen^{zu vermeiden 16}.
8. Stellen Sie das Messskript so ein, dass während der Messungen eine interne Inkubationstemperatur von 30 °C eingehalten wird.
9. Konfigurieren Sie das Messskript so, dass die Daten je nach Präferenz in eine Tabellenkalkulation oder in ASCII-Dateien exportiert werden.

5. Programmierung des Roboters

1. Konfigurieren Sie die Arbeitstischdefinition in der automatisierten Workstation-Software basierend auf dem physischen Layout der Träger (z. B. Heizgeräte, Verschachtelungsplattformen, Beleuchtungsgeräte) und der Laborgeräte (z. B. der 96-Well-Platte) (siehe Materialtabelle). Erstellen Sie ein Skript in der Software der Automatisierungs-Workstation, um Lichtinduktion und Messungen durchzuführen (Abbildung 3), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
2. Deaktivieren Sie alle internen Beleuchtungsquellen, um die Hintergrundaktivierung optogenetischer Systeme zu verhindern.
3. Stellen Sie den Heizrüttler auf eine Temperatur von 30 °C ein. Wenn sich die Platte nicht auf dem Heizrüttler befindet, hat sie Umgebungstemperatur (22 °C).
4. Verwenden Sie Schleifen, einen Timer und eine Schleifenzählvariable, um die Schritte zum Induzieren und Messen der Zellen in regelmäßigen Abständen zu wiederholen.
5. Schütteln Sie vor dem Aufzeichnen der Messungen die Probenplatte, um eine ordnungsgemäße Aufhängung aller Zellen sicherzustellen. Ein 60-s-Shake bei 1.000 U/min mit einem 2-mm-Orbital ist in der Regel ausreichend, um S288C S. cerevisiae-Zellen zu resuspendieren und Messverzerrungen zu vermeiden.
6. Bewegen Sie die Probenplatte mit dem Roboterarm zum Mikroplatten-Reader und entfernen Sie den Deckel (falls zutreffend), um Verzerrungen bei der optischen Dichtemessung zu vermeiden. Die Steuerungssoftware entfernt den Deckel automatisch und setzt ihn wieder an die gewünschte Position, wenn die Definition des Mikroplatten-Reader-Trägers so eingestellt ist, dass keine Deckel zugelassen werden.
7. Führen Sie das Messskript für den Mikroplatten-Reader aus, wie in Schritt 4 beschrieben.
8. Setzen Sie den Deckel auf der Probenplatte wieder auf und bewegen Sie die Platte mit dem Roboterarm zum Beleuchtungsgerät.
9. Stellen Sie das Skript so ein, dass es wartet, bis der Timer das angegebene Zeitintervall erreicht (z. B. 30 Minuten multipliziert mit der Schleifenzählvariablen) und dann die gesamte Schleife für die gewünschte Anzahl von Iterationen wiederholt (z. B. 48 Mal für ein 24-Stunden-Experiment).
10. Beheben Sie potenzielle Fehler und stellen Sie sicher, dass die Träger- und Laborgerätedefinitionen ordnungsgemäß funktionieren, sowie die Fähigkeit des RGA, die Platte genau aufzunehmen und zu platzieren, indem eine leere Platte mehrmals durch die Skriptschleife geführt wird.
11. Konfigurieren Sie Benutzerwarnungen, um den Benutzer über Änderungen des Gerätezustands oder Fehler zu informieren, die während der Ausführung des Protokolls auftreten können.

6. Einrichten der Probenplatte

1. Züchten Sie Hefestämme auf Rich-Media-Platten, wie z. B. YPD-Agar¹⁷ (siehe Materialtabelle). Fügen Sie eine nicht fluoreszierende (negative) Kontrolle hinzu.
2. Wählen Sie Kolonien aus den Platten aus und inokulieren Sie sie in 3 ml SC-Medium¹⁴ (oder ein anderes Medium mit geringer Fluoreszenz, wie z. B. LFM¹⁸) in Glaskulturröhrchen. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 °C auf einer Walzentrommel und halten Sie sie dabei im Dunkeln oder unter nicht ansprechenden Lichtbedingungen (z. B. rotes Licht für blaulichtempfindliche Systeme).
3. Messen Sie die optische Dichte der Übernachtkulturen, indem Sie 200 μl jeder Kultur in 1 ml SC-Medien verdünnen und die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer oder Mikroplatten-Lesegerät aufzeichnen.
4. Jede Kultur über Nacht wird in Glaskulturröhrchen auf einen OD₆₀₀ von 0,1 verdünnt. Für Dehnungstests mit höherem Durchsatz führen Sie automatische Verdünnungen in Mikrotiterplatten durch.
5. Pipettieren Sie die verdünnten Kulturen in die 96-Well-Platte. Fügen Sie für jede Bedingung dreifache Vertiefungen hinzu (d. h. drei identische Vertiefungen mit der gleichen Sorte und den gleichen Lichtverhältnissen), um technische Unterschiede zu berücksichtigen. Schließen Sie Vertiefungen mit leeren Medien und nicht fluoreszierenden Zellen als Negativkontrollen ein, um die Hintergrundfluoreszenz und die optische Dichte zu messen.
6. Inkubieren Sie die Platte bei 30 °C unter Schütteln für 5 Stunden, bevor Sie mit dem Lichtinduktionsexperiment beginnen. Passen Sie die Verdünnungsmengen und Inkubationszeiten nach Bedarf an, um sie für bestimmte Stämme und Versuchsbedingungen zu optimieren.

7. Durchführung des Experiments

1. Legen Sie die Probenplatte auf den Heizschüttler und starten Sie das Automatisierungsskript wie in Schritt 5 beschrieben.
2. Starten Sie das Lichtstimulationsprogramm wie in Schritt 3 beschrieben, sobald die erste Messung auf dem Plattenleser aufgezeichnet wurde.
3. Wenn sich der Automationsarbeitsplatz nicht in einem dunklen Raum befindet, decken Sie ihn mit einem Verdunkelungsvorhang ab, um eine Hintergrundbeleuchtung zu vermeiden.

8. Datenanalyse

1. Erstellen Sie eine Tabellenkalkulation für das Experiment, die das 8 x 12-Layout der 96-Well-Platte widerspiegelt. Stellen Sie sicher, dass die Karte die Namen der in einem Raster gemessenen Dehnungen und Beschreibungen der Lichtverhältnisse enthält, die in einem anderen Raster verwendet werden.
2. Verwenden Sie ein Python-Skript oder eine andere bevorzugte Programmiersprache, um die exportierten Daten zu analysieren. Importieren Sie die Map-Tabelle in ein Array und ordnen Sie die Stammnamen und Bedingungsnamen den einzelnen Vertiefungen der Platte zu.
   HINWEIS: Beispielcode für die Analyse finden Sie unter: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativ kann man eine Anwendung verwenden, um Daten von verschiedenen Plattenlesegeräten¹⁹ zu analysieren.
3. Lesen Sie die Daten aus der exportierten Testtabelle in ein anderes Array.
4. Generieren Sie Diagramme der optischen Dichtewerte und Fluoreszenzwerte für jede Dehnung und jeden Zustand im Laufe der Zeit, wie in Abbildung 4 dargestellt.
5. Untersuchen Sie die optischen Dichtediagramme, um die Stadien des exponentiellen Wachstums oder der Sättigung in den Kulturen zu bestimmen. Diese Informationen helfen bei der Auswahl geeigneter Zeitpunkte für den Vergleich von Fluoreszenzmessungen zwischen Stämmen oder Bedingungen, wie in Abbildung 5 dargestellt.

Ergebnisse

Abbildung 4A zeigt die Fluoreszenzwerte über die Zeit für einen optogenetischen Stamm, der einen fluoreszierenden Reporter exprimiert, der durch einen lichtinduzierbaren Split-Transkriptionsfaktor gesteuert wird. Die unterschiedlichen Lichtverhältnisse, die im Experiment verwendet werden, spiegeln sich in Schwankungen des Tastverhältnisses wider, das den Prozentsatz der Zeit darstellt, in der das Licht eingeschaltet ist. Es wird beobachtet, dass das Gesamtfluoreszenzniveau proportional z...

Diskussion

Das hier vorgestellte Lustro-Protokoll automatisiert die Kultivierungs-, Beleuchtungs- und Messprozesse und ermöglicht so das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme⁶. Dies wird durch die Integration eines Beleuchtungsgeräts, eines Mikroplatten-Readers und eines Schüttelgeräts in einen Automatisierungsarbeitsplatz erreicht. Dieses Protokoll demonstriert insbesondere die Nützlichkeit von Lustro für das Screening verschiedener optogenetischer Konstrukte, die i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500