Hochdurchsatz-Optogenetik-Experimente in Hefe mit der automatisierten Plattform Lustro

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Verwendung der automatisierten Plattform Lustro zur Durchführung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung optogenetischer Systeme in Hefe.

Zusammenfassung

Die Optogenetik bietet eine präzise Kontrolle des zellulären Verhaltens durch die Verwendung genetisch kodierter lichtempfindlicher Proteine. Die Optimierung dieser Systeme, um die gewünschte Funktionalität zu erreichen, erfordert jedoch oft mehrere Design-Build-Test-Zyklen, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein können. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir Lustro entwickelt, eine Plattform, die Lichtstimulation mit Laborautomatisierung kombiniert und so ein effizientes Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme ermöglicht.

Lustro verfügt über einen Automationsarbeitsplatz, der mit einer Beleuchtungsvorrichtung, einer Schüttelvorrichtung und einem Plattenleser ausgestattet ist. Durch den Einsatz eines Roboterarms automatisiert Lustro die Bewegung einer Mikrotiterplatte zwischen diesen Geräten und ermöglicht so die Stimulation optogenetischer Stämme und die Messung ihrer Reaktion. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von Lustro zur Charakterisierung optogenetischer Systeme zur Genexpressionskontrolle in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Protokoll umfasst die Einrichtung der Lustro-Komponenten, einschließlich der Integration des Beleuchtungsgeräts in die Automatisierungsstation. Es enthält auch detaillierte Anweisungen für die Programmierung des Beleuchtungsgeräts, des Plattenlesers und des Roboters, um einen reibungslosen Betrieb und eine reibungslose Datenerfassung während des gesamten Versuchsprozesses zu gewährleisten.

Einleitung

Die Optogenetik ist eine leistungsfähige Technik, die lichtempfindliche Proteine nutzt, um das Verhalten von Zellen mit hoher Präzision zu steuern ^1,2,3. Das Prototyping optogenetischer Konstrukte und die Identifizierung optimaler Beleuchtungsbedingungen können jedoch zeitaufwändig sein, was die Optimierung optogenetischer Systeme erschwert ^4,5. Hochdurchsatzmethoden zum schnellen Screening und zur Charakterisierung der Aktivität optogenetischer Systeme können den Design-Build-Test-Zyklus für das Prototyping von Konst....

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Hefestämme sind in der Materialtabelle dokumentiert. Diese Stämme weisen ein robustes Wachstum im Temperaturbereich von 22 °C bis 30 °C auf und können in verschiedenen Standardhefemedien kultiviert werden.

1. Einrichten des Automationsarbeitsplatzes

1. Statten Sie die automatisierte Workstation mit einem Roboter-Greifarm (RGA, siehe Materialtabelle) aus, der in der Lage ist, Mikrotiterplatten zu bewegen (Abbildung 1).
2. Installieren Sie einen Mikroplatten-Heizschüttler (siehe Materialtabelle) in d....

Diskussion

Das hier vorgestellte Lustro-Protokoll automatisiert die Kultivierungs-, Beleuchtungs- und Messprozesse und ermöglicht so das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme⁶. Dies wird durch die Integration eines Beleuchtungsgeräts, eines Mikroplatten-Readers und eines Schüttelgeräts in einen Automatisierungsarbeitsplatz erreicht. Dieses Protokoll demonstriert insbesondere die Nützlichkeit von Lustro für das Screening verschiedener optogenetischer Konstrukte, die i.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan		Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500