Esperimenti di optogenetica ad alto rendimento nel lievito utilizzando la piattaforma automatizzata Lustro

Riepilogo

Questo protocollo delinea i passaggi per l'utilizzo della piattaforma automatizzata Lustro per eseguire la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici nel lievito.

Abstract

L'optogenetica offre un controllo preciso sul comportamento cellulare utilizzando proteine sensibili alla luce geneticamente codificate. Tuttavia, l'ottimizzazione di questi sistemi per ottenere la funzionalità desiderata richiede spesso più cicli di progettazione-costruzione-test, che possono richiedere molto tempo e manodopera. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato Lustro, una piattaforma che combina la stimolazione della luce con l'automazione di laboratorio, consentendo uno screening efficiente ad alto rendimento e la caratterizzazione dei sistemi optogenetici.

Lustro utilizza una stazione di lavoro di automazione dotata di un dispositivo di illuminazione, un dispositivo di scuotimento e un lettore di piastre. Impiegando un braccio robotico, Lustro automatizza il movimento di una piastra a micropozzetti tra questi dispositivi, consentendo la stimolazione di ceppi optogenetici e la misurazione della loro risposta. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo sull'utilizzo di Lustro per caratterizzare i sistemi optogenetici per il controllo dell'espressione genica nel lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae. Il protocollo copre la configurazione dei componenti Lustro, compresa l'integrazione del dispositivo di illuminazione con la workstation di automazione. Fornisce inoltre istruzioni dettagliate per la programmazione del dispositivo di illuminazione, del lettore di piastre e del robot, garantendo un funzionamento regolare e l'acquisizione dei dati durante tutto il processo sperimentale.

Introduzione

L'optogenetica è una potente tecnica che utilizza proteine sensibili alla luce per controllare il comportamento delle cellule con elevata precisione ^1,2,3. Tuttavia, la prototipazione di costrutti optogenetici e l'identificazione delle condizioni di illuminazione ottimali possono richiedere molto tempo, rendendo difficile l'ottimizzazione dei sistemi optogenetici ^4,5. I metodi ad alto rendimento per lo screening e la caratterizzazione rapida dell'attività dei sistemi optogenici possono accelerare il ciclo di progettazione-costruzione-test per la prototipazione dei costrutti e l'esplorazione della loro funzione.

La piattaforma Lustro è stata sviluppata come tecnica di automazione di laboratorio progettata per lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento di sistemi optogenetici. Integra un lettore di micropiastre, un dispositivo di illuminazione e un dispositivo di scuotimento con una workstation^{di automazione 6}. Lustro combina la coltura automatizzata e la stimolazione luminosa delle cellule in piastre a micropozzetti (Figura 1 e Figura 1 supplementare), consentendo lo screening rapido e il confronto di diversi sistemi optogenetici. La piattaforma Lustro è altamente adattabile e può essere generalizzata per funzionare con altri robot di automazione di laboratorio, dispositivi di illuminazione, lettori di piastre, tipi di cellule e sistemi optogenici, compresi quelli che rispondono a diverse lunghezze d'onda della luce.

Questo protocollo dimostra l'impostazione e l'uso di Lustro per la caratterizzazione di un sistema optogenetico. Il controllo optogenetico dei fattori di trascrizione divisi nel lievito è utilizzato come sistema di esempio per illustrare la funzione e l'utilità della piattaforma sondando la relazione tra gli input luminosi e l'espressione di un gene reporter fluorescente, mScarlet-I⁷. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono semplificare l'ottimizzazione dei sistemi optogenetici e accelerare la scoperta di nuove strategie per il controllo dinamico dei sistemi biologici.

Protocollo

I ceppi di lievito utilizzati in questo studio sono documentati nella Tabella dei Materiali. Queste varietà mostrano una crescita robusta nell'intervallo di temperatura compreso tra 22 °C e 30 °C e possono essere coltivate in vari substrati di lievito standard.

1. Configurazione della postazione di lavoro di automazione

1. Dotare la stazione di lavoro automatizzata di un braccio di presa robotico (RGA, vedere la tabella dei materiali) in grado di spostare le piastre per micropozzetti (Figura 1).
2. Installare un agitatore riscaldatore per micropiastre (vedere Tabella dei materiali) nella stazione di lavoro automatizzata (Figura 1(1)) con un meccanismo di bloccaggio automatico della piastra che fornisce l'accesso RGA.
3. Posizionare un lettore di micropiastre adiacente alla workstation automatizzata (Figura 1(2)), garantendo l'accessibilità RGA.
4. Incorporare un dispositivo di illuminazione per micropiastre (Figura 1(3)) che consenta un comodo accesso RGA. Ne sono un esempio l'optoPlate⁸ (utilizzato in questo studio) o il LITOS⁹ (vedi Tabella dei materiali).

2. Preparazione del dispositivo di illuminazione

1. Costruire e calibrare l'optoPlate (o il dispositivo di illuminazione alternativo) seguendo i metodi^stabiliti 8,10,11.
2. Utilizzare un adattatore sul dispositivo di illuminazione per abilitare l'accesso RGA.
3. Programmare l'optoPlate utilizzando un foglio di calcolo¹⁰ o un'interfaccia grafica¹². Seguire il passaggio 3 per eseguire i programmi di stimolazione della luce.

3. Progettare un programma di stimolazione della luce

1. Determinare le condizioni di luce desiderate per l'esperimento.
2. Immettere le condizioni di luce desiderate, tra cui l'intensità della luce, l'ora di inizio della luce, la durata dell'impulso, il numero di impulsi e la durata dell'interimpulso, in un foglio di calcolo.
   NOTA: Eseguire il flashing di queste informazioni su optoPlate seguendo le istruzioni fornite nel repository GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Tenere presente che la piastra del campione non si illuminerà mentre si trova nel lettore per micropiastre o nell'agitatore riscaldatore. La durata e la frequenza di questi eventi possono richiedere un'ottimizzazione in base a specifiche esigenze sperimentali.
3. Includi condizioni di oscurità per ogni ceppo per consentire misurazioni di fondo adeguate.
4. Per gli esperimenti di caratterizzazione iniziale per valutare la funzionalità del trasformante, utilizzare un'elevata intensità luminosa.
   NOTA: L'intensità della luce deve essere ottimizzata per esperimenti più sensibili, poiché una luce eccessiva può essere fototossica per il lievito¹³.

4. Preparazione del lettore di micropiastre

1. Configurare il lettore di micropiastre per misurare la quantità di interesse desiderata prima di condurre gli esperimenti.
   NOTA: In questo esempio, il lettore per micropiastre è stato configurato per misurare la fluorescenza da un reporter espressa dal ceppo di interesse. Altre uscite, come la luminescenza o la densità ottica, possono essere utilizzate a seconda dei requisiti sperimentali.
2. Coltivare il ceppo di interesse (insieme a un controllo non fluorescente) in terreni sintetici completi (SC)¹⁴ (o in un altro terreno a bassa fluorescenza) (vedere la tabella dei materiali) fino alla massima densità cellulare da misurare. Trasferire le colture in una piastra per micropozzetti con fondo in vetro e pareti nere (vedere Tabella dei materiali) e misurarle per determinare le impostazioni ottimali del lettore per micropiastre.
   NOTA: Garantire letture accurate inserendo correttamente le dimensioni della piastra e misurando la piastra dal basso.
3. Fare riferimento a un database di proteine fluorescenti (ad esempio, fpbase.org) per ottenere spettri approssimativi di assorbimento ed emissione per la proteina fluorescente^{target 15}.
4. Determinare il valore z (distanza tra la piastra e il lettore) eseguendo una scansione z su pozzetti contenenti i ceppi fluorescenti e non fluorescenti. Selezionare il valore z che produce il rapporto segnale/rumore più elevato.
5. Ottimizza gli spettri di assorbimento ed emissione conducendo scansioni di assorbimento ed emissione sui ceppi fluorescenti e non fluorescenti per determinare il rapporto segnale/rumore ottimale.
6. Misurare la deformazione fluorescente con il guadagno impostato al livello ottimale, determinando il guadagno ottico più alto che può essere utilizzato senza causare un errore di misurazione del trabocco.
   NOTA: Questo guadagno ottico deve essere impostato manualmente in modo coerente in tutti gli esperimenti che coinvolgono lo stesso ceppo per garantire la coerenza dei risultati.
7. Preparare uno script di misura (fare riferimento alla Figura 2) nel software del lettore per micropiastre. Questo script configura lo strumento per misurare la densità ottica delle colture e gli spettri di fluorescenza di qualsiasi proteina fluorescente da misurare.
   NOTA: Misurare la densità ottica dei ceppi a 600 nm, a meno che non esprimano proteine fluorescenti rosse. Per i ceppi che esprimono proteine fluorescenti rosse, misurare la densità ottica a 700 nm per evitare distorsioni¹⁶.
8. Impostare lo script di misurazione per mantenere una temperatura di incubazione interna di 30 °C durante le misurazioni.
9. Configurare lo script di misurazione per esportare i dati in un foglio di calcolo o in file ASCII, in base alle preferenze.

5. Programmazione del robot

1. Configurare la definizione del piano di lavoro nel software della workstation automatizzata in base alla disposizione fisica dei supporti (ad esempio, agitatori riscaldanti, piattaforme nest, dispositivi di illuminazione) e del materiale da laboratorio (ad esempio, la piastra a 96 pozzetti) (vedere la tabella dei materiali). Creare uno script nel software della workstation di automazione per eseguire l'induzione della luce e le misurazioni (Figura 3), seguendo i passaggi seguenti.
2. Disabilitare qualsiasi fonte di illuminazione interna per prevenire l'attivazione di fondo dei sistemi optogeneti.
3. Impostare lo scuotitore del riscaldatore in modo che mantenga una temperatura di 30 °C. Quando la piastra non è sullo scuotitore del riscaldatore, sarà a temperatura ambiente (22 °C).
4. Utilizza i cicli, un timer e una variabile di conteggio dei cicli per ripetere i passaggi di induzione e misurazione delle cellule a intervalli regolari.
5. Prima di registrare le misurazioni, agitare la piastra del campione per garantire la corretta sospensione di tutte le cellule. Un scuotimento di 60 s a 1.000 giri/min con un orbitale di 2 mm è generalmente sufficiente per risospendere le cellule di S288C S. cerevisiae ed evitare distorsioni di misurazione.
6. Spostare la piastra del campione sul lettore di micropiastre utilizzando il braccio robotico e rimuovere il coperchio (se applicabile) per evitare distorsioni nella misurazione della densità ottica. Il software di controllo rimuoverà e sostituirà automaticamente il coperchio nella posizione designata se la definizione del supporto del lettore per micropiastre è impostata su non consentire i coperchi.
7. Eseguire lo script di misurazione del lettore di micropiastre come descritto al punto 4.
8. Riposizionare il coperchio sulla piastra del campione e spostare la piastra sul dispositivo di illuminazione utilizzando il braccio robotico.
9. Impostare lo script in modo che attenda che il timer raggiunga l'intervallo di tempo specificato (ad esempio, 30 minuti moltiplicati per la variabile di conteggio del ciclo) e quindi ripetere l'intero ciclo per il numero desiderato di iterazioni (ad esempio, 48 volte per un esperimento di 24 ore).
10. Risolvi i potenziali errori e garantisci il corretto funzionamento delle definizioni del supporto e del materiale da laboratorio, nonché la capacità dell'RGA di prelevare e posizionare con precisione la piastra eseguendo più volte una piastra vuota attraverso il ciclo di script.
11. Configurare gli avvisi utente per notificare all'utente eventuali modifiche o errori di stato dello strumento che possono verificarsi durante l'esecuzione del protocollo.

6. Impostazione della piastra campione

1. Coltiva ceppi di lievito su piastre ricche di mezzi, come l'agar YPD¹⁷ (vedi Tabella dei materiali). Includere un controllo non fluorescente (negativo).
2. Selezionare le colonie dalle piastre e inocularle in 3 mL di terreno SC¹⁴ (o un altro terreno a bassa fluorescenza, come LFM¹⁸) in provette di coltura di vetro. Incubare le colture per una notte a 30 °C su un tamburo a rulli, tenendole al buio o in condizioni di luce non reattiva (ad esempio, luce rossa per sistemi sensibili alla luce blu).
3. Misurare la densità ottica delle colture notturne diluendo 200 μL di ciascuna coltura in 1 mL di terreno SC e registrando la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro o un lettore di micropiastre.
4. Diluire ogni coltura notturna a un OD₆₀₀ di 0,1 in provette di vetro. Per test di deformazione a maggiore produttività, eseguire diluizioni automatiche in piastre a micropozzetti.
5. Pipettare le colture diluite nella piastra a 96 pozzetti. Includere pozzetti triplicati per ogni condizione (cioè tre pozzetti identici con la stessa deformazione e condizione di luce) per tenere conto della variazione tecnica. Includere pozzetti con terreni vergini e celle non fluorescenti come controlli negativi per misurare la fluorescenza di fondo e la densità ottica.
6. Incubare la piastra a 30 °C agitando per 5 ore prima di iniziare l'esperimento di induzione della luce. Regolare le quantità di diluizione e i tempi di incubazione secondo necessità per ottimizzare ceppi specifici e condizioni sperimentali.

7. Esecuzione dell'esperimento

1. Posizionare la piastra campione sull'agitatore del riscaldatore e avviare lo script di automazione come descritto al punto 5.
2. Iniziare il programma di stimolazione della luce come descritto al punto 3 una volta registrata la misurazione iniziale sul lettore di piastre.
3. Se la postazione di lavoro di automazione non si trova in una stanza buia, coprirla con una tenda oscurante per evitare l'illuminazione di fondo.

8. Analisi dei dati

1. Creare un foglio di calcolo per l'esperimento, riflettendo il layout 8 x 12 della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che la mappa includa i nomi delle deformazioni misurate in una griglia e le descrizioni delle condizioni di luce utilizzate in un'altra griglia.
2. Utilizzare uno script Python o un altro linguaggio di programmazione preferito per analizzare i dati esportati. Importare il foglio di calcolo della mappa in un array, associando i nomi dei ceppi e dei nomi delle condizioni a ciascun pozzetto della piastra.
   NOTA: Il codice di esempio per l'analisi è disponibile all'indirizzo: https://github.com/mccleanlab/Lustro. In alternativa, è possibile utilizzare un'applicazione per analizzare i dati provenienti da vari lettori di lastre¹⁹.
3. Leggere i dati dal foglio di calcolo dell'esperimento esportato in un'altra matrice.
4. Generare grafici dei valori di densità ottica e dei valori di fluorescenza per ogni ceppo e condizione nel tempo, come illustrato nella Figura 4.
5. Esaminare i grafici di densità ottica per determinare gli stadi di crescita esponenziale o saturazione nelle colture. Queste informazioni aiuteranno a selezionare i punti temporali appropriati per confrontare le misure di fluorescenza tra ceppi o condizioni, come illustrato nella Figura 5.

Risultati

La Figura 4A mostra i valori di fluorescenza nel tempo per un ceppo optogenetico che esprime un reporter fluorescente controllato da un fattore di trascrizione diviso inducibile dalla luce. Le diverse condizioni di luce utilizzate nell'esperimento sono riflesse dalle variazioni del ciclo di lavoro, che rappresenta la percentuale di tempo in cui la luce è accesa. Si osserva che il livello complessivo di fluorescenza è proporzionale al ciclo di lavoro della stimolazione luminosa. La

Discussione

Il protocollo Lustro qui presentato automatizza i processi di coltivazione, illuminazione e misurazione, consentendo lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici⁶. Ciò si ottiene integrando un dispositivo di illuminazione, un lettore di micropiastre e un dispositivo di scuotimento in una stazione di lavoro di automazione. Questo protocollo dimostra in modo specifico l'utilità di Lustro per lo screening di diversi costrutti optogenetici integrati nel lievito

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (alternative illumination device)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm	Tecan
Spark (plate reader)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (user alert app)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500