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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati Rappresentativi
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo delinea i passaggi per l'utilizzo della piattaforma automatizzata Lustro per eseguire la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici nel lievito.

Abstract

L'optogenetica offre un controllo preciso sul comportamento cellulare utilizzando proteine sensibili alla luce geneticamente codificate. Tuttavia, l'ottimizzazione di questi sistemi per ottenere la funzionalità desiderata richiede spesso più cicli di progettazione-costruzione-test, che possono richiedere molto tempo e manodopera. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato Lustro, una piattaforma che combina la stimolazione della luce con l'automazione di laboratorio, consentendo uno screening efficiente ad alto rendimento e la caratterizzazione dei sistemi optogenetici.

Lustro utilizza una stazione di lavoro di automazione dotata di un dispositivo di illuminazione, un dispositivo di scuotimento e un lettore di piastre. Impiegando un braccio robotico, Lustro automatizza il movimento di una piastra a micropozzetti tra questi dispositivi, consentendo la stimolazione di ceppi optogenetici e la misurazione della loro risposta. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo sull'utilizzo di Lustro per caratterizzare i sistemi optogenetici per il controllo dell'espressione genica nel lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae. Il protocollo copre la configurazione dei componenti Lustro, compresa l'integrazione del dispositivo di illuminazione con la workstation di automazione. Fornisce inoltre istruzioni dettagliate per la programmazione del dispositivo di illuminazione, del lettore di piastre e del robot, garantendo un funzionamento regolare e l'acquisizione dei dati durante tutto il processo sperimentale.

Introduzione

L'optogenetica è una potente tecnica che utilizza proteine sensibili alla luce per controllare il comportamento delle cellule con elevata precisione 1,2,3. Tuttavia, la prototipazione di costrutti optogenetici e l'identificazione delle condizioni di illuminazione ottimali possono richiedere molto tempo, rendendo difficile l'ottimizzazione dei sistemi optogenetici 4,5. I metodi ad alto rendimento per lo screening e la caratterizzazione rapida dell'attività dei sistemi optogenici possono accelerare il ciclo di progettaz....

Protocollo

I ceppi di lievito utilizzati in questo studio sono documentati nella Tabella dei Materiali. Queste varietà mostrano una crescita robusta nell'intervallo di temperatura compreso tra 22 °C e 30 °C e possono essere coltivate in vari substrati di lievito standard.

1. Configurazione della postazione di lavoro di automazione

  1. Dotare la stazione di lavoro automatizzata di un braccio di presa robotico (RGA, vedere la tabella dei materiali) in grado di spostare le piastre per micropozzetti (Figura 1).
  2. Installare un agitatore riscaldatore per micropia....

Risultati Rappresentativi

La Figura 4A mostra i valori di fluorescenza nel tempo per un ceppo optogenetico che esprime un reporter fluorescente controllato da un fattore di trascrizione diviso inducibile dalla luce. Le diverse condizioni di luce utilizzate nell'esperimento sono riflesse dalle variazioni del ciclo di lavoro, che rappresenta la percentuale di tempo in cui la luce è accesa. Si osserva che il livello complessivo di fluorescenza è proporzionale al ciclo di lavoro della stimolazione luminosa. La

Discussione

Il protocollo Lustro qui presentato automatizza i processi di coltivazione, illuminazione e misurazione, consentendo lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici6. Ciò si ottiene integrando un dispositivo di illuminazione, un lettore di micropiastre e un dispositivo di scuotimento in una stazione di lavoro di automazione. Questo protocollo dimostra in modo specifico l'utilità di Lustro per lo screening di diversi costrutti optogenetici integrati nel lievito

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health R35GM128873 e dalla sovvenzione della National Science Foundation 2045493 (assegnata al M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. detiene un premio alla carriera presso lo Scientific Interface del Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. è stato supportato da una sovvenzione di formazione NHGRI per il programma di formazione in scienze genomiche 5T32HG002760. Riconosciamo le fruttuose discussioni con i membri del laboratorio McClean e, in particolare, siamo grati a Kieran Sweeney per aver fornito commenti sul manoscritto.

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glassCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (alternative illumination device)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device)Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper ArmTecanStandard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option
Spark (plate reader)Tecan
Synthetic Complete mediaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (user alert app)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

Riferimenti

  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
  2. Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional....

Ristampe e Autorizzazioni

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