فرز الخلية الواحدة للخلايا الجذعية الوسيطة المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام فرز الخلايا المنشطة بالتألق للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية باستخدام طريقة فرز الخلية الواحدة. على وجه التحديد ، يمكن أن يحقق استخدام الفرز أحادي الخلية نقاء 99٪ من الخلايا المناعية من مجموعة غير متجانسة عند دمجها مع نهج قائم على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

Abstract

تمتلك الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) للكائن الحي قدرة غير عادية على التمايز إلى سلالات متعددة من الخلايا البالغة في الجسم وهي معروفة بخصائصها المناعية والمضادة للالتهابات. يعد استخدام هذه الخلايا الجذعية نعمة لمجال البيولوجيا التجديدية ، ولكنه في الوقت نفسه لعنة على الطب التجديدي والعلاجات بسبب الغموض الخلوي المتعدد المرتبط بها. قد ينشأ هذا الغموض من التنوع في مصدر هذه الخلايا الجذعية ومن ظروف نموها في المختبر ، وكلاهما ينعكس على عدم تجانسها الوظيفي.

وهذا يستدعي منهجيات لتوفير مجموعات نقية ومتجانسة من MSCs للتطبيقات العلاجية. مكن التقدم في مجال قياس التدفق الخلوي من اكتشاف مجموعات الخلية المفردة باستخدام نهج متعدد المعلمات. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحديد وتنقية الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية (SHEDs) من خلال فرز الخلية المفردة بمساعدة الفلورة. حدد التعبير المتزامن للعلامات السطحية ، وهي CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC) ، CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5) ، CD105-allophycocyanin (APC) ، و CD44-V450 ، التعبيرات الإيجابية "الساطعة" ل MSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في النسب المئوية للتعبيرات الرباعية لهذه العلامات الموجبة من المقطع 7 فصاعدا إلى المقاطع اللاحقة.

تم فرز المجموعات السكانية الفرعية ذات النمط المناعي باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية حيث شكلت علامتان موجبتان وعلامة سلبية واحدة فقط معايير التضمين. ضمنت هذه المنهجية صلاحية الخلية للسكان الذين تم فرزهم وحافظت على تكاثر الخلايا بعد الفرز. يمكن استخدام تطبيق المصب لمثل هذا الفرز لتقييم التمايز الخاص بالنسب للمجموعات السكانية الفرعية المسورة. يمكن تطبيق هذا النهج على أنظمة الخلية المفردة الأخرى لتحسين ظروف العزل والحصول على معلومات علامات سطح الخلية المتعددة.

Introduction

يمكن اعتبار الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا المناسبة للعلاجات القائمة على الخلايا ويمكن اعتبارها نظاما قياسيا ذهبيا في الطب التجديدي. يمكن عزل هذه الخلايا من مجموعة متنوعة من المصادر في الجسم بأصول أنسجة مختلفة¹. اعتمادا على أنسجة المصدر ، يعرض كل نوع من أنواع MSC سلوكا غامضا في المختبر ². ويلاحظ هذا بشكل جيد في خصائصها المورفولوجية والوظيفية³. أظهرت دراسات متعددة تباينا داخل النسيل في الأبعاد ، بما في ذلك تمايز الأنسجة البالغة ، والحالة الجينومية ، والبنية الأيضية والخلوية ل MSCs ^2,4.

Protocol

الموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركة: تم استلام عينات لب الأسنان المتساقطة المقشرة البشرية بعد الحصول على الموافقة المستنيرة والموافقة الأخلاقية الكاملة من قبل كلية ومستشفى سري راجيف غاندي لطب الأسنان (SRGCDS) قسم الفم والوجه والفكين ، بنغالورو ، وفقا للمعايير التي وضعتها لجنة التخليص الأخلاقي بالمستشفى ، SRGCDS. بعد ذلك تمت الموافقة على عزل وثقافة وصيانة وتطبيق SHEDs من قبل وامتثالا للإرشادات التي أوصت بها اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) في معهد مانيبال للطب التجديدي ، MAHE - بنغالورو. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الكواشف والمخا....

النتائج

تميزت SHEDs بمقايسات التألق المناعي القياسية التي تظهر التعبير عن vimentin (خيوط وسيطة من النوع الثالث) ، وخيوط الأكتين (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) ، والنوى الملطخة ب DAPI (الشكل 1 أ). لتقدير قدراتها التكاثرية وتشكيل المستعمرات ، تم إجراء فحوصات نمو الخلايا القياسية على المدى القصير. وقد تب?.......

Discussion

في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، من بين مصادر ما بعد الولادة ، جذبت MSCs المشتقة من الأنسجة الفموية اهتماما عميقا بسبب الحد الأدنى من التزاماتها الأخلاقية وإمكانية التمايز الملحوظة متعددة السلالات²¹. حازت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من الضرس الثالث المتأثر و SHEDs على أ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5