인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

요약

이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.

초록

유기체의 중간엽 줄기세포(MSC)는 체내에서 여러 계통의 성체 세포로 분화할 수 있는 특별한 능력을 가지고 있으며 면역 조절 및 항염증 특성으로 알려져 있습니다. 이러한 줄기 세포의 사용은 재생 생물학 분야에 도움이 되지만 동시에 이와 관련된 여러 세포 모호성으로 인해 재생 의학 및 치료제에 골칫거리가 됩니다. 이러한 모호성은 줄기세포의 출처의 다양성과 체외 성장 조건에서 발생할 수 있으며, 둘 다 기능적 이질성을 반영합니다.

이는 치료 응용 분야를 위해 정제된 균질한 MSC 집단을 제공하는 방법론을 보증합니다. 유세포 분석 분야의 발전으로 다중 파라미터 접근법을 사용하여 단일 세포 집단을 검출할 수 있게 되었습니다. 이 프로토콜은 형광 보조 단일 세포 분류를 통해 인간 박리 낙엽 치아(SHED)에서 줄기 세포를 식별하고 정제하는 방법을 설명합니다. 표면 마커, 즉 CD90-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), CD73-페리디닌-엽록소-단백질(PerCP-Cy5.5), CD105-알로피코시아닌(APC) 및 CD44-V450의 동시 발현은 다중 파라미터 유세포 분석을 사용하여 MSC의 "밝은" 양성 발현체를 식별했습니다. 그러나 7번 구절부터 이후 구절까지 이러한 양성 마커의 4중 표현자의 비율이 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다.

면역표현형 하위집단은 2개의 양성 마커와 1개의 음성 마커만 포함 기준을 구성하는 단일 세포 정렬 모드를 사용하여 분류되었습니다. 이 방법론은 분류된 집단의 세포 생존력을 보장하고 분류 후 세포 증식을 유지했습니다. 이러한 분류를 위한 다운스트림 응용 프로그램은 제어된 하위 모집단에 대한 계통별 분화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 분리 조건을 개선하고 다중 세포 표면 마커 정보를 획득하기 위해 다른 단일 세포 시스템에 적용될 수 있습니다.

서문

중간엽 줄기 세포(MSC)는 세포 기반 치료에 적합한 확장 가능한 세포 공급원으로 간주될 수 있으며 재생 의학의 황금 표준 시스템으로 간주될 수 있습니다. 이 세포는 조직 기원이 다른 신체의 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있다¹. 소스 조직에 따라 각 유형의 MSC는 모호한 in vitro 거동^{을 나타낸다 2}. 이것은 형태학적, 기능적 특성에서 잘 관찰된다³. 여러 연구에서 MSC^2,4의 성인 조직 분화, 게놈 상태^, 대사 및 세포 구조를 포함한 차원의 클론 내 변이가 나타났습니다.

세포의 면역표현형은 줄기세포 식별을 위한 유세포 분석의 일반적인 응용 분야였으며 2006년 국제 세포 및 유전자 치료 학회(ISCT)에서 세포를 MSC로 식별하기 위한 최소 기준 목록을 처방하는 데 활용되었습니다. 이 연구는 체 외에서 플라스틱 부착 및 세 가지 계통(골형성, 연골형성, 지방형성)으로 분화할 수 있는 능력과 함께 세포 집단의 ≥95%가 CD105, CD73, CD90을 발현해야 하며,....

프로토콜

윤리 승인 및 참여 동의: 인간 박리 낙엽 치수 샘플은 병원 윤리 승인 위원회(SRGCDS)에서 정한 표준에 따라 벵갈루루의 Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital(SRGCDS) 구강악안면과에서 정보에 입각한 동의와 완전한 윤리적 승인을 받은 후 받았습니다. 그 후 SHED의 분리, 배양, 유지 관리 및 적용은 MAHE - 벵갈루루에 있는 Manipal Institute of Regenerative Medicine의 Institutional Committee for Stem Cell Research(IC-SCR)에서 권장하는 지침에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 시약 및 완충액의 준비

1. 배양 유지용
   1. 미분화 hESC, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-strep)(Pen-strep)에 대한 기초 배지를 사용하여 MSC 세포 배양 배지(10%)를 준비합니다(표 2).
   2. 미분화 hESC, 20% FBS, 1% L-글루타민 및 1% P....

토론

조직 공학 및 재생 의학 분야에서, 출생 후 소스 중 구강 조직 유래 MSC는 최소한의 윤리적 의무와 주목할 만한 다중 계통 분화 가능성으로 인해 깊은 관심을 끌었다²¹. 영향을 받은 제3대구치와 SHED의 치수 줄기세포(DPSC)는 신경퇴행성 및 외상성 질환에 대한 치료 잠재력으로 인해 치과 MSC들 사이에서 가장 주목을 받고 있다²². 이 원고에 설명된 프로토콜은 다중 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5