人脱落乳牙免疫表型间充质干细胞的单细胞分选

摘要

该协议描述了使用单细胞分选方法对人间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的使用。具体而言，当与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，使用单细胞分选可以实现来自异质群体的免疫表型细胞的 99% 纯度。

摘要

生物体的间充质干细胞 （MSC） 具有非凡的能力，可以在体内分化成多种成体细胞谱系，并以其免疫调节和抗炎特性而闻名。这些干细胞的使用对再生生物学领域来说是一个福音，但同时也是再生医学和治疗学的祸根，因为与它们相关的多种细胞模糊性。这些模糊性可能源于这些干细胞来源的多样性和它们的 体外 生长条件，这两者都反映了它们的功能异质性。

这就需要为治疗应用提供纯化、均质的间充质干细胞群体的方法。流式细胞术领域的进步使得使用多参数方法检测单细胞群成为可能。该协议概述了一种通过荧光辅助单细胞分选从人脱落乳牙（SHED）中鉴定和纯化干细胞的方法。同时表达表面标志物，即 CD90-异硫氰酸荧光素 （FITC）、CD73-peridinin-叶绿素蛋白 （PerCP-Cy5.5）、CD105-别藻蓝蛋白 （APC） 和 CD44-V450，使用多参数流式细胞术鉴定了 MSC 的“明亮”阳性表达基因。然而，从第 7 次传代到后来的传代，观察到这些阳性标志物的四重表达者的百分比显着下降。

使用单细胞分型模式对免疫表型亚群进行分选，其中只有两个阳性标记物和一个阴性标记物构成纳入标准。该方法确保了分选群体的细胞活力，并在分选后保持细胞增殖。这种分选的下游应用可用于评估门控亚群的谱系特异性分化。该方法可以应用于其他单细胞系统，以改善分离条件并获取多个细胞表面标记物信息。

引言

间充质干细胞（MSCs）可以被视为适用于细胞疗法的可扩展细胞来源，可以被认为是再生医学的金标准系统。这些细胞可以从体内具有不同组织来源的各种来源中分离出来¹.根据其来源组织，每种类型的间充质干细胞都表现出模棱两可的体外^行为2。这在它们的形态和功能特性中得到了很好的观察³.多项研究表明，间充质干细胞的克隆内变异，包括成体组织分化、基因组状态以及代谢和细胞结构 ^2,4。

细胞免疫表型分析一直是流式细胞术鉴定干细胞的常见应用，国际细胞和基因治疗学会 （ISCT） 于 2006 年利用它来规定将细胞识别为 MSC 的最低标准列表。它指出，除了可塑性粘附和在体外分化为三个谱系（成骨性、成软骨性和产脂性）的能力外，≥95% 的细胞群必须表达 CD105、CD73、CD90，并且这些细胞必须缺乏 CD34、CD45、CD11b、CD14 和 HLA-DR 的表达（≤2% 阳性），如流式细胞术测量的那样⁵.尽管间充质干细胞是在ISCT的最低标准下由一组生物标志物定义的，但它们的免疫特性无法与这些生物标志物进行基准测试，并且需要超越这些标准，以使交叉研究....

研究方案

伦理批准和参与同意：根据医院伦理审查委员会制定的标准，在获得班加罗尔斯里拉吉夫甘地牙科学院和医院 （SRGCDS） 口腔颌面科的知情同意和完全伦理批准后，收到了人类脱落的乳牙髓样本SRGCDS。之后，SHED 的分离、培养、维护和应用得到了班加罗尔马尼帕尔再生医学研究所干细胞研究机构委员会 （IC-SCR） 的批准并符合其推荐的指南。有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 试剂和缓冲液的制备

1. 用于培养维持
   1. 使用未分化hESC的基础培养基，10%胎牛血清（FBS），1%L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素（Pen-strep）制备MSC细胞培养基（10%）（表2）。
   2. 使用未分化hESC的基础培养基，20%FBS，1%L-谷氨酰胺和1%Pen-链球菌制备MSC细胞培养基（20%）（表2）。
   3. 使用未分化 hESC 的基础培养基、1% L-谷氨酰胺和 1% 抗生素 - 抗真菌药（抗抗）制备中和培养基（表 2）。
2. 用于流式细胞术分析和分选
   1. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用2%FBS制备染色缓冲液。
   2. 通过在 1 mL PBS 中加入 1....

讨论

在组织工程和再生医学领域，在出生后来源中，口腔组织来源的间充质干细胞因其最小的伦理义务和显着的多谱系分化潜力而引起了人们的极大兴趣²¹。来自受影响的第三磨牙和 SHED 的牙髓干细胞 （DPSC） 因其在神经退行性疾病和创伤性疾病中的治疗潜力而在牙科间充质干细胞中获得了最多的关注²².本手稿中描述的方案有助于使用多参数方法表征 SHED，并使用单.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5