Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Zusammenfassung

Die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) eines Organismus besitzen eine außergewöhnliche Fähigkeit, sich in mehrere Linien adulter Zellen im Körper zu differenzieren und sind für ihre immunmodulatorischen und entzündungshemmenden Eigenschaften bekannt. Die Verwendung dieser Stammzellen ist ein Segen für das Gebiet der regenerativen Biologie, aber gleichzeitig ein Fluch für die regenerative Medizin und Therapeutika, da sie mit zahlreichen zellulären Mehrdeutigkeiten verbunden sind. Diese Mehrdeutigkeiten können sich aus der Vielfalt der Quelle dieser Stammzellen und aus ihren In-vitro-Wachstumsbedingungen ergeben, die beide ihre funktionelle Heterogenität widerspiegeln.

Dies erfordert Methoden, um gereinigte, homogene Populationen von MSCs für therapeutische Anwendungen bereitzustellen. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie haben den Nachweis von Einzelzellpopulationen mit einem multiparametrischen Ansatz ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt einen Weg zur Identifizierung und Reinigung von Stammzellen aus menschlichen exfolierten Milchzähnen (SHEDs) durch fluoreszenzgestützte Einzelzellsortierung. Die gleichzeitige Expression von Oberflächenmarkern, nämlich CD90-Fluoresceinisothiocyanat (FITC), CD73-Peridin-Chlorophyll-Protein (PerCP-Cy5.5), CD105-Allophycocyanin (APC) und CD44-V450, identifizierte die "hellen", positiven Exprimatoren von MSCs mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie. Es wurde jedoch ein signifikanter Rückgang des Prozentsatzes der vierfachen Exprimatoren dieser positiven Marker von Passage 7 bis zu den späteren Passagen beobachtet.

Die immunphänotypisierten Subpopulationen wurden im Einzelzell-Sortiermodus sortiert, wobei nur zwei positive und ein negativer Marker die Einschlusskriterien darstellten. Diese Methodik stellte die Zelllebensfähigkeit der sortierten Populationen sicher und hielt die Zellproliferation nach der Sortierung aufrecht. Die nachgeschaltete Anwendung für eine solche Sortierung kann verwendet werden, um die linienspezifische Differenzierung für die abgegrenzten Teilpopulationen zu evaluieren. Dieser Ansatz kann auf andere Einzelzellsysteme angewendet werden, um die Isolationsbedingungen zu verbessern und Informationen über mehrere Zelloberflächenmarker zu erhalten.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) können als skalierbare Zellquelle angesehen werden, die für zellbasierte Therapien geeignet ist, und können als Goldstandardsystem in der regenerativen Medizin angesehen werden. Diese Zellen können aus einer Vielzahl von Quellen im Körper mit unterschiedlicher Gewebeherkunft isoliert werden¹. Abhängig von ihrem Ausgangsgewebe zeigt jede Art von MSC ein mehrdeutiges In-vitro-Verhalten ². Dies zeigt sich gut in ihren morphologischen und funktionellen Eigenschaften³. Mehrere Studien haben intraklonale Variationen in den Dimensionen gezeigt, einschließlich der ....

Protokoll

Ethische Genehmigung und Zustimmung zur Teilnahme: Menschliche Proben von gefolterter Zahnpulpa wurden nach Einholung der Einverständniserklärung und der vollständigen ethischen Genehmigung durch die Mund-, Kiefer- und Gesichtsabteilung des Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, in Übereinstimmung mit den vom Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS, festgelegten Standards erhalten. Danach wurden Isolierung, Kultur, Aufrechterhaltung und Anwendung von SHEDs genehmigt und in Übereinstimmung mit den vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) am Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru empfohlenen Richtl....

Diskussion

Auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin haben unter den postnatalen Quellen aus oralem Gewebe gewonnene MSCs aufgrund ihrer minimalen ethischen Verpflichtungen und ihres bemerkenswerten Multilineage-Differenzierungspotenzials großes Interesse geweckt²¹. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus dem betroffenen dritten Molaren und SHEDs haben aufgrund ihres therapeutischen Potenzials bei neurodegenerativen und traumatischen Erkrankungen die größte Aufmerksamkeit unter dentale.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5