Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Zusammenfassung

Die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) eines Organismus besitzen eine außergewöhnliche Fähigkeit, sich in mehrere Linien adulter Zellen im Körper zu differenzieren und sind für ihre immunmodulatorischen und entzündungshemmenden Eigenschaften bekannt. Die Verwendung dieser Stammzellen ist ein Segen für das Gebiet der regenerativen Biologie, aber gleichzeitig ein Fluch für die regenerative Medizin und Therapeutika, da sie mit zahlreichen zellulären Mehrdeutigkeiten verbunden sind. Diese Mehrdeutigkeiten können sich aus der Vielfalt der Quelle dieser Stammzellen und aus ihren In-vitro-Wachstumsbedingungen ergeben, die beide ihre funktionelle Heterogenität widerspiegeln.

Dies erfordert Methoden, um gereinigte, homogene Populationen von MSCs für therapeutische Anwendungen bereitzustellen. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie haben den Nachweis von Einzelzellpopulationen mit einem multiparametrischen Ansatz ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt einen Weg zur Identifizierung und Reinigung von Stammzellen aus menschlichen exfolierten Milchzähnen (SHEDs) durch fluoreszenzgestützte Einzelzellsortierung. Die gleichzeitige Expression von Oberflächenmarkern, nämlich CD90-Fluoresceinisothiocyanat (FITC), CD73-Peridin-Chlorophyll-Protein (PerCP-Cy5.5), CD105-Allophycocyanin (APC) und CD44-V450, identifizierte die "hellen", positiven Exprimatoren von MSCs mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie. Es wurde jedoch ein signifikanter Rückgang des Prozentsatzes der vierfachen Exprimatoren dieser positiven Marker von Passage 7 bis zu den späteren Passagen beobachtet.

Die immunphänotypisierten Subpopulationen wurden im Einzelzell-Sortiermodus sortiert, wobei nur zwei positive und ein negativer Marker die Einschlusskriterien darstellten. Diese Methodik stellte die Zelllebensfähigkeit der sortierten Populationen sicher und hielt die Zellproliferation nach der Sortierung aufrecht. Die nachgeschaltete Anwendung für eine solche Sortierung kann verwendet werden, um die linienspezifische Differenzierung für die abgegrenzten Teilpopulationen zu evaluieren. Dieser Ansatz kann auf andere Einzelzellsysteme angewendet werden, um die Isolationsbedingungen zu verbessern und Informationen über mehrere Zelloberflächenmarker zu erhalten.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) können als skalierbare Zellquelle angesehen werden, die für zellbasierte Therapien geeignet ist, und können als Goldstandardsystem in der regenerativen Medizin angesehen werden. Diese Zellen können aus einer Vielzahl von Quellen im Körper mit unterschiedlicher Gewebeherkunft isoliert werden¹. Abhängig von ihrem Ausgangsgewebe zeigt jede Art von MSC ein mehrdeutiges In-vitro-Verhalten ². Dies zeigt sich gut in ihren morphologischen und funktionellen Eigenschaften³. Mehrere Studien haben intraklonale Variationen in den Dimensionen gezeigt, einschließlich der Differenzierung von adultem Gewebe, des genomischen Zustands sowie der metabolischen und zellulären Architektur von MSCs ^2,4.

Die Immunphänotypisierung von Zellen ist eine gängige Anwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Stammzellen und wurde 2006 von der Internationalen Gesellschaft für Zell- und Gentherapie (ISCT) genutzt, um eine Liste von Mindestkriterien zur Identifizierung von Zellen als MSCs vorzuschreiben. Darin heißt es, dass neben der plastischen Adhärenz und der Fähigkeit, sich in drei Linien (osteogen, chondrogen und adipogen) in vitro zu differenzieren, ≥95 % der Zellpopulation CD105, CD73 und CD90 exprimieren müssen, und diesen Zellen muss die Expression (≤2 % positiv) von CD34, CD45, CD11b, CD14 und HLA-DR fehlen, gemessen durch Durchflusszytometrie⁵. Obwohl die MSCs durch eine Reihe von Biomarkern nach den Minimalkriterien des ISCT definiert wurden, konnten ihre Immuneigenschaften nicht mit diesen Biomarkern verglichen werden, und es bestand ein Bedarf an weiteren über diese Kriterien hinausgehenden Kriterien, um studienübergreifende Vergleiche und klonale Variationen leichter quantifizierbar zu machen².

Trotz der vom ISCT festgelegten Richtlinien haben umfangreiche Forschungen zu MSCs gezeigt, dass in dieser Population Heterogenität besteht, die auf eine Vielzahl von Faktoren zurückzuführen sein könnte, hauptsächlich aufgrund der Allgegenwart der Heterogenität, die zwischen MSC-Spendern⁶, Gewebequellen⁷, einzelnen Zellen innerhalb einer klonalen Population⁸ und den Kulturbedingungen ^2,9 entsteht^{. 10}. Anmelden Die Charakterisierung und Reinigung dieser Primärzellen aus einer Vielzahl von Gewebequellen, um die Qualität und das Zellschicksal sicherzustellen, sind wichtige Schritte bei ihrer Herstellung. Die Notwendigkeit, die angezeigten Variationen innerhalb der Grundgesamtheit zu verstehen, erfordert eine effiziente Methode, um sie in Teilpopulationen aufzulösen, die unterteilt und separat gesammelt werden können¹¹. Analysen auf Einzelzellebene tragen dazu bei, die Herausforderungen der Zell-Zell-Variation zu überwinden, das biologische Rauschen zu reduzieren, das durch eine heterogene Population entsteht, und bieten die Möglichkeit, seltene Zellen zu untersuchen und zu charakterisieren¹².

Basierend auf dem Zweck und den gewählten Parametern können verschiedene Methoden angewendet werden, um die ausgewählten Populationen zu sortieren und anzureichern. Zellsortiertechniken können sowohl Massensortier- als auch Einzelzellensortierverfahren umfassen. Während die Massensortierung Zielpopulationen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS)13, Fraktionierung 14 und Elutriation¹⁵ anreichern kann, kann die Einzelzellsortierung homogenere Populationen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)¹¹ anreichern. Eine vergleichende Analyse jeder dieser Methoden mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Vergleichende Analysen verschiedener Techniken: MACS, Fraktionierung, Elutriation und FACS, wobei die Unterschiede in ihrem Prinzip und die Vor- und Nachteile der Wahl einer bestimmten Technik gegenüber einer anderen hervorgehoben werden. Abkürzungen: MACS = Magnetisch aktivierte Zellsortierung; FACS = Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Seit dem Aufkommen der Technik spielt die Einzelzell-Durchflusszytometrie eine wichtige Rolle bei der Zählung¹⁶, dem Nachweis und der Charakterisierung einer spezifischen Zellpopulation in einer heterogenen Probe¹⁷. Hewitt et al. legten 2006 den Grundstein für eine automatisierte Zellsortierungsmethode, um die Isolierung homogener Pools differenzierter humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) zu ^verbessern18. Die Einzelzellsortierung reicherte die Population der GFP-transduzierten hES-Zellen an und erleichterte die Isolierung genetisch veränderter Klone, was eine neue Dimension in der klinischen Forschung eröffnete. Um die Sortiereffizienz zu verbessern, wurden im Allgemeinen zwei Ansätze gewählt; Entweder werden die Sammelmedien der sortierten Populationen modifiziert, um die Lebensfähigkeit und Proliferation der nachsortierten Zellen¹⁹ aufrechtzuerhalten, oder der Zellsortierungsalgorithmus/die Zellsortierungssoftware wird entsprechend modifiziert¹².

Mit dem technologischen Fortschritt konnten kommerzielle Durchflusszytometer und Zellsortierer dazu beitragen, Herausforderungen zu bewältigen, die bei der aseptischen Sortierung fragiler und seltener Zellpopulationen, insbesondere Stammzellen unterschiedlicher Herkunft, bewältigt wurden. Eine der größten Herausforderungen für Stammzellbiologen war die klonale Isolierung menschlicher pluripotenter Stammzellen nach Transfektionsprotokollen, die in Gen-Editing-Studien erforderlich sind¹⁹. Dies wurde durch die Sortierung einzelner Zellen in 96-Well-Platten gelöst, die mit embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus zusammen mit Nahrungsergänzungsmitteln und kommerziellen niedermolekularen ROCK-Inhibitoren beschichtet wurden. Die Strategien zur Zellisolierung konnten jedoch durch die Verwendung der Indexsortierung, einer Funktion des Sortieralgorithmus, die den Immunphänotyp einzelner sortierter Zellen identifiziert, weitgehend verfeinert werden¹². Diese verfeinerte Modalität in der Einzelzellsortierung trug nicht nur dazu bei, die Sortiereffizienz von Stammzellen zu verbessern, insbesondere im Hinblick auf seltene hämatopoetische Stammzellpopulationen, sondern verknüpfte auch Einzelzellklone effizient mit ihren nachgeschalteten funktionellen Assays²⁰.

Diese Arbeit konzentriert sich auf die Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten Stammzellen aus menschlichen exfolierten Milchzähnen (SHEDs) zur Anreicherung von Subpopulationen, um ihre funktionellen Differenzierungsfähigkeiten zu untersuchen. Mit einer Kombination aus zwei MSC-positiven Markern, CD90 und CD73, und einem negativen hämatopoetischen Marker CD45 wurden die MSCs immunphänotypisiert und die Dim- und Null-Expressionoren identifiziert. Basierend auf ihrem Immunphänotyp wurden die Subpopulationen als reine MSCs, einfach positive und doppelt negative Populationen identifiziert. Sie wurden im Einzelzell-Sortiermodus sortiert, um reine und angereicherte Subpopulationen für weitere funktionelle Studien zu erhalten, um festzustellen, ob die differentielle Expression von Markern ein Artefakt der In-vitro-Kulturbedingungen ist oder ob sie auch einen Einfluss auf die funktionellen Eigenschaften hat. Zellen, die keine homogenen Exprimatoren der "positiven MSC-Marker" waren, wurden sortiert, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen.

Protokoll

Ethische Genehmigung und Zustimmung zur Teilnahme: Menschliche Proben von gefolterter Zahnpulpa wurden nach Einholung der Einverständniserklärung und der vollständigen ethischen Genehmigung durch die Mund-, Kiefer- und Gesichtsabteilung des Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, in Übereinstimmung mit den vom Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS, festgelegten Standards erhalten. Danach wurden Isolierung, Kultur, Aufrechterhaltung und Anwendung von SHEDs genehmigt und in Übereinstimmung mit den vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) am Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru empfohlenen Richtlinien genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung von Reagenzien und Puffern

1. Für die Kulturpflege
   1. Bereiten Sie MSC-Zellkulturmedien (10 %) unter Verwendung von Basalmedium für undifferenzierte hES-Zellen, 10 % fötales Kälberserum (FBS), 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) vor (Tabelle 2).
   2. Bereiten Sie MSC-Zellkulturmedien (20 %) unter Verwendung von Basalmedium für undifferenzierte hES-Werte, 20 % FBS, 1 % L-Glutamin und 1 % Pen-Streptokokken vor (Tabelle 2).
   3. Neutralisierendes Medium mit Basalmedium für undifferenzierte hES-Werte, 1 % L-Glutamin und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum (Anti-Anti) herstellen (Tabelle 2).
2. Zur durchflusszytometrischen Analyse und Sortierung
   1. Färbepuffer mit 2 % FBS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herstellen.
   2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 μg/ml) vor, indem Sie 1 μl in 1 ml PBS zugeben
3. Zur linienspezifischen Differenzierung von MSCs
   1. Differenzierungsmedien für die osteogene, chondrogene und adipogene Differenzierung gemäß der in Tabelle 3 beschriebenen Zusammensetzung herstellen. Lagern Sie die vorbereiteten Aliquots für die Dauer des Versuchs bei 4 °C.
   2. Bereiten Sie serumarme Medien (2 % Medien) unter Verwendung von Basalmedium für undifferenzierte hES-Werte, 2 % FBS, 1 % L-Glutamin und 1 % Pen-Streptokokken vor (Tabelle 2).

ART DES MEDIUMS			ZWECK DER MEDIEN			ZUSAMMENSETZUNG FÜR 50 ml
						FBS	Pen-Streptokokken	L-Glutamin	BASALES MEDIUM FÜR UNDIFFERENZIERTE hES-Zellen
10% Medien			MSC-Kultur und -Pflege			5 ml	500 μl	500 μl	44 ml
20% Medien			CFU-F-Assay			10 ml	500 μl	500 μl	39 ml
Serumarme (2 %) Medien			Medien für Kontrollwellen im Differenzierungsprotokoll			1 ml	500 μl	500 μl	48 ml
Neutralisierende Medien			Medien zur Neutralisierung der Zellsuspension nach der Trypsinisierung			-	500 μl	500 μl	49 ml

Tabelle 2: Zellkulturmedien für die Kulturpflege und Assays. Abkürzungen: MSC = mesenchymale Stammzelle; CFU-F = koloniebildende Einheit-Fibroblasten.

KOMPONENTEN	OSTEOGENE MEDIEN	CHONDROGENE MEDIEN	ADIPOGENE MEDIEN
Basales Medium	90 ml	90 ml	90 ml
Induktionsmedien	10 ml	10 ml	10 ml
Gesamtvolumen	100 ml	100 ml	100 ml

Tabelle 3: Differenzierungsmedien für die Trilineage-Differenzierung von SHEDs.

2. Kultur und Pflege von SHEDs

1. Halten Sie die Zellen in 10%igen MSC-Nährmedien und führen Sie alle 2 Tage oder nach Bedarf einen Medienwechsel durch.
2. Trypsinisierung von Zellen bei 95 % Konfluenz unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA.
3. Neutralisieren Sie die Zellen nach der Trypsinisierung mit neutralisierenden Medien.
4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für 6 Minuten bei Raumtemperatur, um ein Zellpellet zu erhalten.
5. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10%igen MSC-Nährmedien.
6. Besiedeln Sie Zellen in frisch zubereitete Zellkulturschalen, die 10 % MSC-Nährmedien enthalten, für weitere Experimente oder Subkulturen.
   HINWEIS: Die optimale Aussaatdichte für SHEDs beträgt 0,2 × 10 6 Zellen in einer 100-mm-Schale und 0,8 × 10 6 Zellen in einem T-75-Kolben, um 1,5 × 10 6 Zellen bzw. 4 × 10 ⁶ Zellen bei 90-100 % Konfluenz zu erhalten.

3. Charakterisierung von MSCs

1. Kurzzeit-Zellwachstums-Assay
   1. Säen Sie 4 × 10⁴ Zellen/Well in dreifacher Ausführung in 6-Well-Platten in 10%igen MSC-Nährmedien.
   2. Inkubieren Sie die Platten 7 Tage lang bei 37 °C und führen Sie alle 2 Tage einen Medienwechsel durch.
   3. Entnehmen Sie die Zellen an den Tagen 2, 4 und 8 mit 0,25 % Trypsin und waschen Sie sie mit Nährmedien.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Medium.
   5. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bestimmen Sie ihre Lebensfähigkeit mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.
   6. Berechnen Sie die Proliferationsrate mit Gleichung (1):
      (1)
2. Koloniebildender Unit-Fibroblasten-Assay (CFU-F)
   1. Säen Sie 10.000 Zellen in einer 100-mm-Schale und kultivieren Sie sie in 20%igen MSC-Nährmedien.
   2. Inkubieren Sie die Platten 14 Tage lang bei 37 °C und führen Sie alle 3 Tage einen Medienwechsel durch.
   3. Spülen Sie die Kolonien nach 14 Tagen mit PBS, fixieren Sie sie mit kristallviolettem Farbstoff in Methanol und spülen Sie erneut mit PBS, um den Restfleck zu entfernen.
   4. Zähle und bilde die Kolonien.
      HINWEIS: Zählen Sie Kolonien mit >50 Zellen. Die koloniebildende Effizienz wird als koloniebildende Einheitszahlen berechnet.
3. Immunfluoreszenz-Assay
   1. Säen Sie die MSCs auf 35-mm-Schalen und lassen Sie sie bis zu 80-90% Konfluenz wachsen.
   2. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie das Geschirr einmal mit PBS ab.
   3. Fixieren Sie die Zellen mit 1 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA), indem Sie entweder 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Nach der Fixierung die Vertiefungen mit PBST 3 x 5 min auf der Wippe waschen.
   5. Fügen Sie 0,3 % Triton X-100 in PBST (0,05 % Tween-20-Lösung in PBS) hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren. Halten Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Wippe.
   6. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBST für 3 x 5 min auf der Wippe.
   7. Fügen Sie 3 % Rinderserumalbumin (BSA) zum Blockieren hinzu und lassen Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Wippe.
   8. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBST für 3 x 5 min auf der Wippe.
   9. Fügen Sie 800 μl einer 1:500-Verdünnung von Maus-Antivimentin hinzu, lassen Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Wippe und überführen Sie die Platte zur Inkubation über Nacht auf 4 °C.
   10. Entfernen Sie am nächsten Tag den primären Antikörper und waschen Sie die Vertiefungen mit PBST für 3 x 5 min auf der Wippe.
   11. 800 μl 1:1.000 Verdünnung des kreuzadsorbierten Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-Sekundärantikörpers Alexa Fluor 555 zugeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur auf der Wippe aufbewahren.
   12. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBST für 3 x 5 min auf der Wippe.
   13. Alexa fluor 488 Phalloidin-Sonden 240 μl in 1.000 μl PBS geben und bei Raumtemperatur 60 Minuten auf der Wippe inkubieren.
   14. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBST für 3 x 5 min auf der Wippe.
   15. Fügen Sie 700 μl DAPI-Eindeckmittel hinzu und beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop.
4. Abstammungsspezifische Differenzierung
   1. Differenzierung nach 2D-Kultur
      1. Nehmen Sie zwei 48-Well-Platten und kennzeichnen Sie sie als osteogene bzw. adipogene Abstammungslinien.
      2. Säen Sie 15.000 Zellen/Well in vier Wells jeder Platte und kultivieren Sie sie in 10%igen MSC-Nährmedien.
      3. Sobald die Monoschicht der Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht hat, kennzeichnen Sie die ersten beiden Vertiefungen als "Kontrolle" und ersetzen Sie die vorhandenen Medien durch serumarme Medien (2 % Medien). In den letzten beiden Vertiefungen, die als "Test" gekennzeichnet sind, fügen Sie Differenzierungsmedien einer der beiden Abstammungslinien hinzu, adipogen oder osteogen. Markieren Sie dies als Tag 0.
      4. Tauschen Sie das Medium jeden dritten Tag vorsichtig aus, um ein Ablösen zu vermeiden, und achten Sie darauf, eine Kontamination zu vermeiden.
      5. Halte diese Bedingungen bis zum einundzwanzigsten Tag aufrecht; dann Prozess für das Färbeexperiment.
   2. Differenzierung nach 3D-Kultur
      1. Nehmen Sie zwei 15-ml-Röhrchen zur Durchführung einer chondrogenen Differenzierung mit einer 3D-Pelletkultur.
      2. 1 × 10⁶ Zellen in jedes Röhrchen überführen und bei 300 × g 6 min zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden. Beschriften Sie ein Röhrchen als "Kontrolle" und fügen Sie 10 % MSC-Nährmedien hinzu. Kennzeichnen Sie das andere Röhrchen als "Test" und fügen Sie chondrogene Differenzierungsmedien hinzu. Legen Sie die Röhrchen vorsichtig mit locker verschraubten Kappen in den Inkubator. Markieren Sie dies als Tag 0.
      3. Wechseln Sie das Medium jeden dritten Tag sorgfältig, um das Pellet während des Medienwechsels nicht zu lösen/aufzulösen.
      4. Halten Sie diese Bedingungen bis zum einundzwanzigsten Tag aufrecht und verarbeiten Sie dann die Zellen für weitere Experimente.
5. Abstammungsspezifische zytochemische Färbung
   1. Verwenden Sie für 2D-Kulturen die differenzierten (Test) und undifferenzierten MSCs (Kontrollplatten) (aus Schritt 3.4.1.5.) für die Färbung, entfernen Sie zunächst das Medium und waschen Sie es zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 4% PFA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sie einmal mit PBS. Führen Sie die Färbung für jede Linie wie folgt durch.
      1. Für die Adipozyten-Abstammung fügen Sie Permeabilisierungslösung aus dem Kit hinzu und inkubieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 1 ml Ölrot-O-Arbeitslösung vor und fügen Sie sie hinzu und bewahren Sie sie 10 Minuten lang auf. Entfernen Sie den Fleck und waschen Sie ihn fünf Mal mit destilliertem Wasser.
      2. Für die Osteozyten-Abstammung 5% frisch zubereitetes Silbernitrat (in destilliertem Wasser) in jede Vertiefung geben und die Platte 1 Stunde lang unter UV-Strahlung halten. Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie 2,5% Natriumthiosulfat hinzu, um das nicht umgesetzte Silber zu entfernen. 5 Minuten einwirken lassen. Entfernen Sie den Fleck, waschen Sie ihn zweimal mit destilliertem Wasser und beobachten Sie die gefärbten Zellen unter dem Mikroskop.
   2. Bei 3D-Kulturen wird das Pellet nach dem Ende des Differenzierungszeitraums aus Schritt 3.4.2.3 entnommen und Kryoschnitte des differenzierten Gewebes in Form des Pellets erhalten. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen und haben sie Raumtemperatur, bevor Sie mit dem Färben fortfahren.
      1. Befolgen Sie für die Chondrozytenlinie die Anweisungen des Färbekits, um eine ausreichende Menge an Waschlösung hinzuzufügen, entfernen Sie sie, fügen Sie die Fixierlösung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Mit destilliertem Wasser waschen, die Färbelösung hinzufügen und 30 Minuten inkubieren. Dreimal mit 0,1 N Salzsäure waschen; Füge destilliertes Wasser hinzu, um die Säure zu neutralisieren. Beobachten Sie die gefärbten Zellen unter einem Hellfeldmikroskop.

4. Zelloberflächenfärbung zur Immunphänotypisierung

HINWEIS: Empfohlene Zellkulturplatten, um eine optimale Anzahl von Zellen in den Schritten 4.2-4.5 zu erhalten, sind 100-mm-Schalen oder T75-Kolben.

1. Zellvorbereitung für durchflusszytometrische Experimente
   1. Trypsinisieren und sammeln Sie die Zellen aus einer konfluierenden Schale/einem Kolben und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 6 Minuten, um das Zellpellet zu erhalten.
   2. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Medium und bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer nach der Trypanblau-Ausschlussmethode.
   3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension nach dem Zählen erneut und waschen Sie das Pellet zweimal mit 1 ml Färbepuffer.
   4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet schließlich in einem geeigneten Volumen des Färbepuffs je nach Protokoll (siehe Schritte 4.2 bis 4.5).
2. Vorbereitung von Vergütungskontrollen
   1. Nehmen Sie sieben FACS-Röhrchen und kennzeichnen Sie sie als Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 und APC.
   2. Resuspendieren Sie das fertige Pellet im Färbepuffer (siehe Schritt 4.1) und behalten Sie dabei eine Zelldichte von 0,5 × 10⁶ Zellen pro 50 μl pro Röhrchen für die ungefärbten und DAPI-Röhrchen bei.
   3. Bereiten Sie die einfach gefärbten Röhrchen für die Kompensation vor, wie in Tabelle 4 beschrieben.
   4. Jedes Röhrchen nach der Zubereitung vorsichtig vortexen und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
   5. Nach der Inkubation werden zwei Wäschen durchgeführt, indem 1 ml Färbepuffer in jedes Röhrchen gegeben werden, gefolgt von einem kurzen Wirbel und einer Zentrifugation bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Färbepuffer und legen Sie es bis zur Aufnahme beiseite.
   7. Führen Sie für das DAPI-Röhrchen eine Hitzeschockbehandlung durch, indem Sie es 5 Minuten lang in einem 60 °C warmen Wasserbad und anschließend 15 Minuten auf Eis inkubieren. Geben Sie 5 μl DAPI in die Aufhängung und lassen Sie sie bis zur Lauferfassung im Dunkeln.
3. Herstellung von Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO)
   1. Resuspendieren Sie das fertige Pellet in Färbepuffer (siehe Schritt 4.1) und behalten Sie dabei eine Zelldichte von 0,5 × 10⁶ Zellen pro 50 μl für jedes Röhrchen bei.
   2. Nehmen Sie fünf FACS-Röhrchen und kennzeichnen Sie sie als CD44-V450-Isotyp, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5-Isotyp und CD105-APC-Isotyp.
   3. Bereiten Sie die Zell- und Antikörpersuspension gemäß Tabelle 5 vor.
   4. Die Röhrchen vorsichtig vortexen und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   5. Nach der Inkubation werden zwei Wäschen mit 1 ml Färbepuffer in jedes Röhrchen gegeben, gefolgt von kurzem Wirbeln und Zentrifugieren bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Färbepuffer und legen Sie es bis zur Aufnahme beiseite.
4. Vorbereitung der Proben für die Analyse
   1. Resuspendieren Sie das fertige Pellet im Färbepuffer (siehe Schritt 4.1) und behalten Sie dabei eine Zelldichte von 0,5 × 10⁶ Zellen pro 50 μl für jedes Röhrchen bei.
   2. Nehmen Sie zwei FACS-Röhrchen und beschriften Sie sie als gemischte Röhrchen 1 und 2.
   3. Bereiten Sie die Zell- und Antikörpersuspension gemäß Tabelle 6 vor.
   4. Die Röhrchen vorsichtig vortexen und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   5. Nach der Inkubation werden zwei Wäschen mit 1 ml Färbepuffer in jedes Röhrchen gegeben, gefolgt von kurzem Wirbeln und Zentrifugieren bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Färbepuffer und legen Sie es bis zur Akquisition beiseite.
5. Vorbereitung von Proben für die Einzelzellsortierung
   1. Nehmen Sie zwei FACS-Röhrchen, fügen Sie 1 ml FBS hinzu und rollen Sie das Röhrchen herum, bis sich auf der Innenseite jedes Röhrchens eine gleichmäßige FBS-Schicht bildet. Inkubieren Sie dies für 1-2 Stunden, während Sie die Probe für die Färbung verarbeiten. Beschriften Sie diese Röhrchen als gemischte Röhrchen 1 und 2.
   2. Das fertige Pellet wird in den Färbepuffer (siehe Schritt 4.1) resuspendiert, wobei eine Zelldichte von 2-3 × 10⁶ Zellen pro 50 μl für jedes Röhrchen beibehalten wird.
   3. Bereiten Sie die Zell- und Antikörpersuspension in gemischten Röhrchen 1 und 2 gemäß Tabelle 7 vor.
   4. Die Röhrchen vorsichtig vortexen und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   5. Nach der Inkubation werden zwei Wäschen mit 1 ml Färbepuffer in jedes Röhrchen gegeben, gefolgt von kurzem Wirbeln und Zentrifugieren bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Färbepuffer und stellen Sie es beiseite. 5 μl DAPI 15 Minuten vor dem Sortieren hinzufügen.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass für Sortierexperimente eine höhere Zelldichte pro Röhrchen empfohlen wird.

Röhren-Typ	Positive Comp Perlen*	Negative Comp Perlen*	Zellen	Antikörper hinzugefügt
FITC-Schlauch	1 Tropfen	1 Tropfen	–	Anti-Human-CD90-FITC (2 μl)
V450 Röhre	1 Tropfen	1 Tropfen	–	Anti-Human-CD44-V450 (2 μl)
PerCP-Cy 5.5 Röhre	1 Tropfen	1 Tropfen	–	Anti-humanes CD73-PerCP Cy 5,5 (2 μl)
PE-Rohr	1 Tropfen	1 Tropfen	–	Anti-humanes CD45-PE (2 μl)
APC-Röhre	1 Tropfen	1 Tropfen	–	Anti-Human-CD105-APC (2 μl)
DAPI-Röhre	–	–	50 μl	–
Ungefärbte Röhre	–	–	50 μl	–
*1 Tropfen = 60 μl Kügelchensuspension

Tabelle 4: Kompensationskontrollproben. Abkürzungen: Comp = Kompensation; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; APC = Allophycocyanin; PE = Phycoerythrin; PerCP = Peridin-Chlorophyll-Protein.

RÖHRCHEN-TYP	ANTIKÖRPER GEGEN POSITIVEN MARKER (2 μL)			ANTIKÖRPER GEGEN NEGATIVEN MARKER (2 μL)	HINZUGEFÜGTE ISOTYP-ANTIKÖRPER (2 μL)	GESAMTVOLUMEN DER ANTIKÖRPER	VOLUMEN DER ZUGEGEBENEN ZELLSUSPENSION	VOLUMEN DES ZUGEGEBENEN FÄRBEPUFFS
CD90-FITC FMO-Röhre	- Anti-Human-CD44-V450			Anti-Human-CD45-PE	FITC IgG1 Isotyp	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD73 PerCP Cy 5.5
	- Anti-humanes CD105-APC
CD73-PerCP Cy5.5 FMO-Röhre	- Anti-Human-CD44-V450			Anti-Human-CD45-PE	PerCP Cy 5.5 IgG1 Isotyp	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD90-FITC
	- Anti-humanes CD105-APC
CD44-V450 FMO-Röhre	- Anti-Human-CD90-FITC			Anti-Human-CD45-PE	V450 IgG1 Isotyp	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD73-PerCP Cy 5.5
	- Anti-humanes CD105-APC
CD105-APC FMO-Röhre	- Anti-Human-CD44-V450			Anti-Human-CD45-PE	APC IgG1 Isotyp	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD90-FITC
	- Anti-Human-CD73-PerCP Cy 5.5
CD45-PE FMO-Röhrchen	- Anti-Human-CD44-V450			-	PE IgG1 Isotyp	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD90-FITC
	- Anti-Human-CD73-PerCP Cy 5.5
	- Anti-humanes CD105-APC

Tabelle 5: FMO-Kontrollproben. Abkürzungen: FMO = Fluoreszenz minus eins; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; APC = Allophycocyanin; PE = Phycoerythrin; PerCP = Peridin-Chlorophyll-Protein.

RÖHRCHEN-TYP	ANTIKÖRPER GEGEN POSITIVEN MARKER (2 μL)		ANTIKÖRPER GEGEN NEGATIVEN MARKER (2 μL)	GESAMTVOLUMEN DER ANTIKÖRPER	VOLUMEN DER ZUGEGEBENEN ZELLSUSPENSION	VOLUMEN DES ZUGEGEBENEN FÄRBEPUFFS
Gemischte Röhre 1	- Anti-Human-CD44-V450		Anti-Human-CD45-PE	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD90-FITC
	- Anti-humanes CD73-PerCP Cy5.5
	- Anti-humanes CD105-APC
Gemischte Röhre 2	- Anti-Human-CD44-V450		Anti-Human-CD45-PE	10 μl	50 μl	40 μl
	- Anti-Human-CD90-FITC
	- Anti-humanes CD73-PerCP Cy5.5
	- Anti-humanes CD105-APC

Tabelle 6: Probenröhrchen für die mehrfarbige Immunphänotypisierung von SHEDs. Abkürzungen: SHEDs = Stammzellen aus menschlichen abgeblätterten Milchzähnen; PE = Phycoerythrin.

RÖHRCHEN-TYP	ANTIKÖRPER GEGEN POSITIVEN MARKER (3 μL)		ANTIKÖRPER GEGEN NEGATIVEN MARKER (3 μL)	GESAMTVOLUMEN DER ANTIKÖRPER	VOLUMEN DER ZUGEGEBENEN ZELLSUSPENSION	VOLUMEN DES HINZUGEFÜGTEN FLECKENPUFFERS
Gemischte Röhre 1	- Anti-Human-CD90-FITC		Anti-Human-CD45-PE	9 μl	50 μl	41 μl
	- Anti-humanes CD73-PerCP Cy5.5
Gemischte Röhre 2	- Anti-Human-CD90-FITC		Anti-Human-CD45-PE	9 μl	50 μl	41 μl
	- Anti-humanes CD73-PerCP Cy5.5

Tabelle 7: Einzelzell-Sortierreaktionsröhrchen. Abkürzungen: FITC = Fluoresceinisothiocyanat; PE = Phycoerythrin; PerCP = Peridin-Chlorophyll-Protein.

5. Sortierung einzelner Zellen

1. Vorbereitung des Zellsortierers
   1. Installieren Sie eine 100-μm-Düse im Sortierer.
      HINWEIS: Die geeignete Düse hat mindestens das Fünffache des Durchmessers des zu sortierenden Partikels. Die für die Sortierung zu verwendende Mantelflüssigkeit muss auf der Grundlage des Probentyps und der Empfindlichkeit des Experiments entschieden werden. Für dieses Experiment wurde proprietäre Mantelflüssigkeit verwendet.
   2. Führen Sie die tägliche Qualitätsprüfung (QC) des Instruments durch und richten Sie den Sortierer für das Experiment ein. Im Gerätehandbuch finden Sie eine detaillierte Anleitung zur Geräteeinrichtung.
2. Einrichten der Vergütungsmatrix
   1. Stellen Sie die Kompensationsmatrix mit Hilfe von Einzelflecken-Kompensationsröhrchen aus Schritt 4.2 ein.
   2. Wählen Sie in der proprietären Software in der Symbolleiste Experiment aus und klicken Sie auf Kompensations-Setup. Öffnen Sie Steuerelemente für die Kompensation erstellen.
   3. Überprüfen Sie die Markierungen und bestätigen Sie. Es wird eine neue Probe mit dem Namen "Kompensation" hinzugefügt, unter der neue Röhrchen, die als Marker-Steuerelemente bezeichnet werden, automatisch von der Software hinzugefügt werden.
   4. Wählen Sie die ungefärbte Röhre aus, und führen Sie sie aus, um 5.000 Ereignisse aufzuzeichnen. Ziehen Sie das Gatter auf die Grundgesamtheit der Zellen und wenden Sie es auf alle Kompensationssteuerelemente an. Damit werden die Spannungen und das negative Gate für jeden Fluoreszenzparameter eingestellt.
   5. Legen Sie auf ähnliche Weise die Röhrchen zur Korrektur einzelner Flecken separat ein und zeichnen Sie die Daten auf und speichern Sie sie. Wählen Sie das Gate aus, das die Grundgesamtheit von Interesse abgrenzt, und wenden Sie es auf alle Kompensationskontrollen an. Damit werden die positiven Gates für jeden Fluoreszenzparameter eingestellt.
   6. Wählen Sie in der Symbolleiste Experiment aus und klicken Sie auf Kompensationswerte berechnen | verknüpfen und speichern.
      HINWEIS: Sobald die Auto-Comp-Matrix mit der Software generiert wurde, können die Spannungsparameter der Fluorochrome für keinen der Kanäle in den gemischten Röhren geändert werden.
3. Datenerfassung
   1. Zeichnen Sie 10.000 Zellen in jedem Röhrchen aus Schritt 4.3 auf. und 4.4 zur Erhebung von Daten zur Analyse des Immunphänotyps der Zellen.
4. Vorbereitung der Auffangvorrichtungen
   1. Je nach Verwendungszweck der sortierten Zellpopulationen wählen Sie zwischen 6-Well-, 24-Well-, 48-Well- oder 96-Well-Platten.
   2. Beschichten Sie die Vertiefungen mit 200-500 μl FBS und lassen Sie die Platten 2 h lang ungestört.
   3. Entfernen Sie nach 2 h das restliche FBS und fügen Sie 200-500 μl 10%ige MSC-Nährmedien hinzu.
5. Zellensortierung im Einzelzellen-Sortiermodus
   1. Führen Sie Mixed Tube 1 (ab Schritt 4.5) aus, und zeichnen Sie 10.000 Ereignisse auf, um die Gatter für die zu sortierende Grundgesamtheit mit der entsprechenden Gating-Strategie festzulegen.
   2. Laden Sie eine Sammelplatte, stellen Sie die Anzahl der Zielzellen zwischen 2.500 und 5.000 Zellen/Well ein und wählen Sie die Reinheitsmaske für die Einzelzellsortierung aus.
   3. Sammeln Sie die sortierten Populationen in der Sammelvorrichtung und lassen Sie sie bis zum Ende des Sortierexperiments auf Eis.
   4. Sobald dies erledigt ist, werden die Platten in den 5% CO₂ -Inkubator überführt, um die Kulturen bei 37 °C zu halten.
      HINWEIS: Nach der Erfassung wurden die Rohdatendateien im .fcs-Dateiformat exportiert (ab Version 3.0). Die Sortierberichte, die nach jedem Experiment erstellt wurden, zeichneten die Anzahl der Ereignisse/Zellen auf, die nach zugewiesenen Vertiefungen sortiert waren, und gaben die Anzahl der Konflikte an, die abgebrochen wurden.

Ergebnisse

Die SHEDs wurden mit Standard-Immunfluoreszenzassays charakterisiert, die die Expression von Vimentin (rot, Typ-III-Intermediärfilamente), Aktinfilamenten (Alexa fluor 488 Phalloidin-Sonden) und mit DAPI gefärbten Zellkernen zeigten (Abbildung 1A). Um ihre proliferativen und koloniebildenden Fähigkeiten abzuschätzen, wurden Standard-Kurzzeit-Zellwachstumsassays durchgeführt. Ein 14,3-facher Anstieg der Proliferationsrate von Tag 2 bis Tag 8 ist in Abbildung 1B

Diskussion

Auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin haben unter den postnatalen Quellen aus oralem Gewebe gewonnene MSCs aufgrund ihrer minimalen ethischen Verpflichtungen und ihres bemerkenswerten Multilineage-Differenzierungspotenzials großes Interesse geweckt²¹. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus dem betroffenen dritten Molaren und SHEDs haben aufgrund ihres therapeutischen Potenzials bei neurodegenerativen und traumatischen Erkrankungen die größte Aufmerksamkeit unter dentale...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5