تقييم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا باستخدام مقايسة الفلورسنت القائمة على قارئ اللوحة

Summary

يوفر تقييم استهلاك الأكسجين معلومات متكاملة حول وظيفة الميتوكوندريا. باستخدام مسبار فسفوري مع قارئ لوحة فلورية ، يمكن الحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار بسهولة بدون معدات متخصصة. يمكن هذا الاختبار أي مختبر من قياس استهلاك الأكسجين للميتوكوندريا المعزولة وحساب نسب التحكم في الجهاز التنفسي.

Abstract

تخدم الميتوكوندريا العديد من الوظائف المهمة ، بما في ذلك التنفس الخلوي ، وإنتاج ATP ، والتحكم في موت الخلايا المبرمج ، والعمل كمحور مركزي لمسارات التمثيل الغذائي. لذلك ، يمكن أن يوفر التقييم التجريبي لوظائف الميتوكوندريا نظرة ثاقبة للاختلافات بين المجموعات السكانية المختلفة أو الحالات المرضية. بالإضافة إلى ذلك ، من المفيد تقييم ما إذا كانت الميتوكوندريا المعزولة صحية بما يكفي لمتابعة التجارب. إحدى الخصائص التي غالبا ما تستخدم لمقارنة وظيفة الميتوكوندريا في عينات مختلفة هي معدل استهلاك الأكسجين. يمكن أن يخدم استهلاك الأكسجين والحساب اللاحق لنسبة التحكم في الجهاز التنفسي في الخلايا السليمة أو الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة الأغراض الثلاثة. باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من كبد سحالي الفرشاة بالتزامن مع مسبار فسفوري حساس للتقلبات في تركيز الأكسجين في المحلول ، قمنا بقياس استهلاك الأكسجين باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت. هذه الطريقة ليست سريعة وفعالة فحسب ، بل يمكن إجراؤها أيضا بكمية صغيرة من الميتوكوندريا ودون الحاجة إلى معدات متخصصة. يزيد البروتوكول خطوة بخطوة الموصوف هنا من إمكانية وصول الباحثين إلى التقييم الوظيفي للميتوكوندريا.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات ، بحجم البكتيريا تقريبا ، توجد في الخلايا حقيقية النواة. إنها عضيات فريدة لأنها تحتوي على الحمض النووي ولها غشاءان ، أحدهما خارجي وداخلي. يتم فصل الأغشية الخارجية والداخلية للميتوكوندريا عن طريق مساحة بين الغشاء ، ويتم طي الغشاء الداخلي في هياكل تسمى كريستا حول الحجرة الأعمق ، والتي تسمى المصفوفة. تزيد هذه الكريستا من مساحة سطح الغشاء الداخلي بحيث يمكن أن تحدث عمليات متعددة تستخدم الكريستا في وقت واحد. بينما تشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية مثل التحكم في موت الخلايا المبرمج وإيواء مسارات التمثيل الغذائي المتعددة ، فإن دورها الحيوي في إنتاج ATP ضروري لبقاء الخلية. في الواقع ، 90٪ من طاقة الخلية مشتقة من الميتوكوندريا¹. يتضمن إنتاج ATP توليد فرق كهروكيميائي عبر الأغشية الخارجية والداخلية ، يسمى إمكانات غشاء الميتوكوندريا (Δψ) ، والتي تنشأ عندما يتم ضخ أيونات H ⁺ من المصفوفة إلى الفضاء بين الغشاء. يتم تسخير إنتاج ATP في النهاية أثناء أكسدة المكافئات المختزلة عن طريق حركة الإلكترون عبر سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا (ETC). متقبل الإلكترون النهائي هو الأكسجين الجزيئي (O₂). مع استهلاك الأكسجين ، يتراكم فرق تركيز H ⁺ إلى الحد الأقصى ، وعند هذه النقطة تتحرك أيونات H ⁺ لأسفل تدرج تركيزها من الفضاء بين الغشاء إلى المصفوفة عن طريق المرور عبر مركب سينسيز ATP. تسبب حركة أيونات H ⁺ تغييرا توافقيا في سينسيز ATP ، ويتم إحضار ADP بالقرب من الفوسفات غير العضوي للتفاعل وتوليد ATP. أخيرا ، يتم نقل ATP من مصفوفة الميتوكوندريا إلى العصارة الخلوية ويمكن تخزينها أو استخدامها لتسهيل التفاعلات بسبب الكمية الكبيرة من الطاقة الحرة المنبعثة أثناء التحلل المائي للفوسفات. تسمى هذه العملية برمتها بالفسفرة المؤكسدة ، وبما أن الأكسجين يستهلك ، يقال إن الميتوكوندريا تتنفس².

يمكن استخدام تراكم وقوة Δψ ، وكمية O₂ المخفضة (تسمى استهلاك الأكسجين) ، بالإضافة إلى توليد ATP كمؤشرات على صحة الخلية. يمكن قياس الدراسات الوظيفية للميتوكوندريا ، مثل قياس Δψ ، ومحتوى ATP الكلي وإنتاجه ، واستهلاك الأكسجين إما عن طريق الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية أو التألق والتلألؤ في المقايسات القائمة على اللوحة. على سبيل المثال ، يمكن مقارنة إمكانات غشاء الميتوكوندريا بين عينات مختلفة باستخدام أصباغ الفلورسنت مثل إستر رباعي ميثيل رودامين إيثيل ، الذي يرتبط على وجه التحديد بالميتوكوندريا. يمكن مراقبة توليد ATP عن طريق إضافة بروتين مضيء إلى تفاعل ترتبط تغيره بتركيز ATP. يمكن أن يساعد القياس الكمي لمعدلات استهلاك الأكسجين ، أو المعدلات المطلقة للتنفس ، أثناء OXPHOS ، في توضيح أسباب التفاوتات في وظيفة الميتوكوندريا واستقلاب الطاقة. يمكن استخدام تقييم استهلاك الأكسجين لحساب نسب التحكم في الجهاز التنفسي (RCRs). تصف قيم RCR قدرة الميتوكوندريا على صنع ATP استجابة لتدفق ADP ، وهي الوظيفة الرئيسية للميتوكوندريا. تشير قيم RCR إلى الحالة العامة للميتوكوندريا المعزولة وتسمح بمقارنة الاستجابات للعلاجات التجريبية المختلفة. قد تمثل الاختلافات في قيم RCR خللا وظيفيا في الميتوكوندريا أو تشير إلى اختلاف بيولوجي بين الميتوكوندريا المختلفة المعزولة من مصدرين أو أكثر. مقياس مهم آخر للوظيفة في الميتوكوندريا المعزولة هو كفاءة الميتوكوندريا التي تعرف على أنها مولات ATP مركبة لكل مول من O₂ ، أو نسبة P / O³.

نظرا لكمية المعلومات التي يمكن جمعها من قياس معلمات الميتوكوندريا والحالات المختلفة التي يمكن فيها استخدام هذه المعلومات ، يمكن أن تكون القدرة على جمع البيانات الوظيفية بكفاءة مفيدة في العديد من مجالات البحث المختلفة. تم إجراء قياسات استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا لعقود من الزمن باستخدام أجهزة محددة للغاية - باستخدام قطب كلارك ، والذي يمكن أن يكون محدودا بحجم العينة اللازم لإجراء القياسات ، ومؤخرا ، أدوات متطورة يمكنها قياس تنفس الميتوكوندريا والعديد من المعلمات الأخرى ولكن يمكن أن تكون باهظة التكلفة. هذا البروتوكول هو نهج بديل مكيف باستخدام مسبار فسفوري حساس للأكسجين (MitoXpress)^4،5. يتم الكشف عن إشارة المسبار باستخدام قارئ لوحة في وضع التألق الذي تم حله بمرور الوقت لإجراء قياسات مستمرة بمرور الوقت. يحتوي الفسفور على فرق طاقة أكبر بين الفوتون الممتص والمنبعث مقارنة بالمضان ، وبالتالي فهو أكثر ملاءمة للمراقبة المستمرة للتغيرات في الإشارة. يتيح ذلك لأي مختبر تقريبا إجراء هذه القياسات ، وليس فقط أولئك الذين يركزون على استقلاب الميتوكوندريا أو الذين يمكنهم تحمل تكاليف المعدات المتخصصة للغاية. النظام النموذجي الذي نستخدمه هو الميتوكوندريا المعزولة من ثلاث سحالي شجرية ، ونوعين من الوالدين وواحد داخلي (يحتوي على الحمض النووي النووي من أحد الأنواع الأبوية والميتوكوندريا من الآخر - الهجينة). تم اختيار هذه السحالي لأننا افترضنا أن هناك عواقب استقلابية وطاقة للهجينة التي لها مصادر مختلفة للحمض النووي النووي والميتوكوندريا. استخدمنا مجموعة فحص متوفرة تجاريا مع قارئ لوحة متعدد الأوضاع يمكنه زيادة الوصول إلى هذا النوع من الاختبارات لمزيد من الباحثين ومجالات البحث.

Protocol

تم القتل الرحيم للسحالي عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بقطع الرأس الفوري وفقا للسياسات الموضحة في مكتب رعاية مختبرات وإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في إيلون.

1. عزل الميتوكوندريا⁶

ملاحظة: حافظ على جميع المحاليل باردة (الجدول 1) والعينات على الجليد خلال هذه الخطوات.

1. قم بإزالة الكبد ووزنه ثم اشطفه ب ~ 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (1x ، -/-).
2. افرم الكبد في 1 مل من L-MIB بشفرة حلاقة جديدة.
3. ارفع الحجم الإجمالي للأنسجة بالإضافة إلى L-MIB إلى 2 مل وقم بتعطيل خلايا الكبد ميكانيكيا لمدة أربع تمريرات باستخدام الخالط Dounce.
4. قم بتدوير الجانس عند 300 × جم (37 درجة مئوية ، 10 دقائق).
5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وضعها على الثلج.
6. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من L-MIB ، وأعد تجانس ، ثم قم بالتدوير مرة أخرى عند 300 × جم (37 درجة مئوية ، 10 دقائق).
7. اجمع بين المواد الطافية من كل من الدوران وأجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم (37 درجة مئوية ، 10 دقائق).
8. أعد تعليق الحبيبات في ~ 0.350 مل من L-MIB.
9. تحديد كمية البروتين الكلي (ملغ من الميتوكوندريا / مل من L-MIB) لاستخدامها كتقريب لمحتوى الميتوكوندريا^4،5،6.

2. استهلاك الأكسجين

1. قم بتسخين جميع المحاليل المستخدمة (الجدول 1) في الخطوات التالية إلى 30 درجة مئوية في حمام مائي.
2. قم بتخفيف الميتوكوندريا في LEB إلى 6 مجم / مل بناء على نتائج فحص تركيز البروتين في الخطوة 1.9.
3. قم بإعداد الفحص في لوحة سفلية شفافة معقمة ذات جدار أسود سعة 96 بئرا (الجدول 2).
   1. أضف 50 ميكرولتر من العينة (عازلة L-EB أو عينة الميتوكوندريا) إلى الآبار المناسبة.
   2. أضف 50 ميكرولتر من العلاج (L-EB أو الغلوتامات / المالات أو الغلوتامات / الملات مع ADP).
   3. قم بتخفيف مخزون المسبار 1:10 في L-EB ثم أضف 100 ميكرولتر من مسبار الفلورسنت إلى كل بئر.
   4. أضف برفق 50 ميكرولتر من الزيت المعدني الثقيل إلى كل بئر لاستبعاد الأكسجين المحيط.
4. اقرأ قياسات الفلورسنت من أسفل اللوحة عند 380/650 نانومتر من الإثارة / الانبعاث كل 1.5 دقيقة لمدة 45 دقيقة. استخدم الوضع الحركي مع تأخير زمني يبلغ 30,000 ميكرو ثانية ونافذة قياس تبلغ 100 ميكرو ثانية.

3. تحليل البيانات

1. قم بتصدير ملف البيانات الأولية من كمبيوتر قارئ اللوحة كملف .xls.
2. افتح الملف، ثم انسخ البيانات الأولية ولصقها في علامة تبويب جديدة، وقم بتسمية الصفوف والأعمدة بشكل مناسب.
3. ارسم المخزن المؤقت L-EB فقط على عينة التحكم و L-EB + G / M كوحدات فلورية نسبية (RFU) مقابل الوقت.
   ملاحظة: يجب أن تكون هذه الخطوط مسطحة نسبيا حيث لا توجد ميتوكوندريا ، وبالتالي ، لا ينبغي اكتشاف أي تغيير في تركيز الأكسجين.
4. ارسم قيم عينة L-EB + G/M كRFU مقابل الوقت.
5. حدد المكان الذي تصبح فيه القراءات أكثر اتساقا وتسطيحها لعناصر التحكم.
   ملاحظة: هذا هو المكان الذي يجب أن يبدأ فيه تحليل البيانات للعينات التجريبية (مميز بأسهم في الشكل 1 أ). يمكن أن تستغرق ردود الفعل من 10 إلى 15 دقيقة لتسطيح وتصل إلى الحد الأقصى.
6. قم بإنشاء مخطط جديد يحتوي فقط على البيانات بعد النقطة الزمنية المحددة في الخطوة 3.5 (تسمى البيانات "المقتطعة") وأضف الخط الأنسب لتصور البيانات الأولية المراد تحليلها.
7. احسب متوسط قيمة RFU لبيانات المخزن المؤقت للتحكم المقتطعة فقط (مظللة باللون الأصفر). تستخدم هذه القيمة كحد أدنى لقيمة RFU كخط الأساس في حساب الأكسجين أدناه.
8. حساب معدل استهلاك الأكسجين (ميكرو مولار O₂ / دقيقة)
   1. انسخ والصق المنطقة الخطية للبيانات الأولية من الخطوة 3.6 (أي البيانات المقطوعة) لتحديد تركيز الأكسجين في عينات الميتوكوندريا في معالجة G / M + ADP في كل نقطة زمنية^7،8،9،10.
   2. استخدم المعادلة (1)⁵ لتحديد تركيز الأكسجين في كل نقطة زمنية. [س₂]_أ هو تركيز الأكسجين في المخزن المؤقت المشبع بالهواء (235 ملي مولار عند 30 درجة مئوية). I (t) و Ia و Io هي إشارة الفلورسنت للعينة + المسبار في الوقت t (على سبيل المثال ، العينة + G / M + ADP) ، ومتوسط إشارة المسبار في المخزن المؤقت المشبع بالهواء المحسوبة في الخطوة 3.7 ، والإشارة القصوى في المخزن المؤقت غير المؤكسج (تم ضبطه عند الحد الأقصى للإشارة التي يمكن تحقيقها) ، على التوالي.
      (1)
   3. ارسم قيم [O₂] _t المحسوبة في الخطوة 3.8.2 مقابل الوقت وأضف خط اتجاه خطي مع معادلة الخط الأنسب.
      ملاحظة: استخدم منحدر كل سطر كمعدل استهلاك الأكسجين. يمكن تجميع النسخ المكررة أو الثلاثية لأي عينة واستخدامها لمقارنة معدل الاستهلاك.
9. احسب RCR بقسمة تنفس الميتوكوندريا مع وبدون ADP ، والتي تمثل الحالتين 3 و 2 ، على التوالي.

النتائج

تم تحديد معدل استهلاك الأكسجين والميتوكوندريا RCR من الميتوكوندريا لثلاث سحالي مختلفة باستخدام مجموعة فحص مع مسبار استشعار الأكسجين الفسفوري وقارئ لوحة فلورة قياسي. أثبتت الأبحاث السابقة أن المسبار الموجود في هذه المجموعة يرتبط ارتباطا مباشرا باستهلاك الأكسجين ، حيث ي...

Discussion

يعد قياس وظيفة الميتوكوندريا مفيدا عند مقارنة العينات المختلفة ، مثل الحالات المرضية مقابل الحالات غير المرضية ، أو أنواع الأنسجة المختلفة من نفس ، أو بين أنواع العينات المختلفة. استخدمنا المقارنة اللاحقة لاختبار فرضيتنا القائلة بأن هناك نتيجة أيضية لسحالي الأشجار ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well black/optical bottom plates	Thermo Fisher	265301	Untreated black-wall plates with clear bottoms.
ADP	Sigma	A2754	Dilute 100 µM stock with EB immediately before use.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Make 2 mg/mL stock in water for protein assay.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure the PBS is without Mg2+ or Ca2+ ions.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-glutamic acid	Sigma	G1251
L-glutamic acid potassium salt	Sigma	S372226
L-malic acid	Sigma	M8304
L-malic acid mono-potassium salt	Sigma	49601
MitoXpress oxygen consumption kit	Agilent	MX-200-4	Kit contains probe stock and HS mineral oil.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Dye (5x)	BioRad	500-0006	Any protein assay can substitute.
R version 3.3	R Core Development Team 2016
Thermomax microplate reader EnSpire Multi-mode Plate reader and software	PerkinElmer		Standard fluorescent plate-reader
Trisma base	Sigma	T6066	Any version of Tris base can be utilized.