JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يؤكد هذا البروتوكول على استخراج وثقافة وحفظ الخلايا الجذعية متعددة القدرات من لب الأسنان من خلال الهضم الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوضح قدرتها على التمايز إلى بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية ، مما يسلط الضوء على أهمية الدقة والاتساق في العملية.

Abstract

في مجال الطب التجديدي والتطبيقات العلاجية ، تكتسب أبحاث الخلايا الجذعية زخما سريعا. برزت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) ، الموجودة في كل من الأسنان اللبنية والدائمة ، كمصدر حيوي للخلايا الجذعية نظرا لإمكانية الوصول إليها وقدرتها على التكيف وقدرات التمايز الفطرية. توفر DPSCs خزانا وفيرا ومتاحا بسهولة من الخلايا الجذعية الوسيطة ، مما يعرض تنوعا وإمكانات رائعة ، خاصة لأغراض التجدد. على الرغم من وعدهم ، تكمن العقبة الرئيسية في عزل وتوصيف DPSCs بشكل فعال ، نظرا لتمثيلهم ككسر دقيق داخل خلايا لب الأسنان. نفس القدر من الأهمية هو الحفاظ السليم على هذا المورد الخلوي الذي لا يقدر بثمن. الطريقتان السائدتان لعزل DPSC هما الهضم الأنزيمي (ED) والنمو من نباتات الأنسجة (OG) ، وغالبا ما يشار إليها باسم النمو التلقائي. يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على نهج الهضم الأنزيمي لعزل DPSC ، مع تفصيل الخطوات التي تشمل الاستخراج والمعالجة داخل المختبر والحفاظ على الخلايا. بالإضافة إلى الاستخراج والحفظ ، يتعمق البروتوكول في براعة التمايز ل DPSCs. على وجه التحديد ، يحدد الإجراءات المستخدمة لحث هذه الخلايا الجذعية على التمايز إلى خلايا دهنية ، بانيات عظمية ، وخلايا غضروفية ، وعرض سماتها متعددة القدرات. يسهل الاستخدام اللاحق لتقنيات التلوين اللوني التصور الدقيق وتأكيد التمايز الناجح ، وبالتالي التحقق من عيار ووظائف DPSCs المعزولة. يعمل هذا البروتوكول الشامل كمخطط يشمل مجموعة كاملة من استخراج الخلايا الجذعية لب الأسنان وزراعتها وحفظها وتوصيفها. إنه يؤكد على الإمكانات الكبيرة التي تؤويها DPSCs ، مما يدفع استكشاف الخلايا الجذعية إلى الأمام ويبشر بالاختراقات التجديدية والعلاجية المستقبلية.

Introduction

ازدهرت أبحاث الخلايا الجذعية في العلوم الطبية الحيوية بسبب تطبيقاتها الواعدة في الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. جذبت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) ، المشتقة من أنسجة اللب لكل من الأسنان اللبنية البشرية والدائمة ، اهتماما كبيرا كمصدر للخلايا الجذعية نظرا لتوافرها الجاهز وقدرتها المتعددة 1,2. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الشحمية ، وبانيات العظم ، والخلايا الغضروفية ، كما أكدت العديد من الدراسات3.

على مدى العقود القليلة الماضية ، ارتفعت الأبحاث والتطبيقات العلاجية للخلايا الجذعية. تتطلب الإمكانات التوسعية للخلايا الجذعية تنويع المصادر التي يتم الحصول عليها منها. هناك عدة عوامل تؤثر على كفاءة الخلايا المختارة وقابليتها للحياة وجذعها. على الرغم من وجود العديد من خزانات الخلايا الجذعية المعروفة ، مثل نخاع العظام والأنسجة الدهنية ، فإن الإجراءات الغازية ، ومراضة الموقع ، والمخاوف الأخلاقية المرتبطة بهذه المصادر غالبا ما تحد من استكشافها 4,5. من بين مصادر الخلايا الجذعية المختلفة ، اكتسبت الخلايا الجذعية السنية الاهتمام بسبب سهولة الوصول إليها ، واللدونة العالية ، والتطبيقات المحتملة المتنوعة. تم بحث الخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية ، على وجه الخصوص ، على نطاق واسع لآفاقها العلاجية6. الأسنان ، التي يتم التخلص منها عادة كنفايات طبية ، تحتوي على ثروة من الخلايا الجذعية الوسيطة7. يتطلب الحفاظ على هذا التجمع القيم للخلايا الجذعية جهودا جماعية من المرضى وأطباء الأسنان والأطباء لضمان عدم إهدار هذه الموارد ، مما يجعل كل خلية جذعية لب الأسنان متاحة لمتطلبات التجدد المستقبلية.

توجد الخلايا الجذعية المشتقة من لب الأسنان ، مثل الخلايا الجذعية لب الأسنان البالغة (DPSCs) والخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية البشرية المقشرة (SHED) ، في مكانة حول الأوعية الدموية في لب الأسنان. يعتقد أن هذه الخلايا تنشأ من خلايا القمة العصبية القحفية وتظهر علامات مبكرة لكل من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) والخلايا الجذعية العصبية الظاهرة. أظهرت DPSCs و SHEDs تعدد القدرات والقدرة على تجديد أنواع الأنسجة المتنوعة8.

تشمل المصادر المحتملة للخلايا الجذعية السنية الأسنان اللبنية والدائمة الصحية. تشكل الخلايا الجذعية حوالي 1٪ فقط من إجمالي عدد الخلايا في اللب ، مما يسلط الضوء على أهمية تقنيات العزل والتوسع الفعالة9. وبالتالي ، فإن استخراج وتوسيع هذه الخلايا الجذعية هي خطوات محورية في عزل DPSC10. يجب تخزين الأسنان المستخرجة أو المقشرة في وسط نقل غني بالمغذيات ، مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول ملحي مخزن من هانكس (HBSS).

يمكن الحصول على لب الأسنان من خلال طرق مختلفة ، اعتمادا على نوع السن 7,11. بالنسبة للأسنان اللبنية ذات الجذور الممتصة ، يمكن إجراء الاستخراج عبر قمة الجذر. وبالمثل ، يمكن استخدام الدبابيس الشائكة المعقمة للحصول على اللب من الأسنان الدائمة ذات القمة المفتوحة غير الناضجة. في حالات الأسنان الدائمة ذات الجذور المتطورة بالكامل ، يتضمن الوصول إلى حجرة اللب فصل تاج الأسنان عن الجذر. يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع السن باستخدام قرص ماسي عند تقاطع المينا الأسمنتية. يكشف هذا الشق حجرة اللب ، مما يتيح استرجاع أنسجة اللب12،13،14.

يمكن عزل الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من خلال الهضم الأنزيمي (ED) أو النمو من نباتات الأنسجة (OG) ، والمعروف أيضا باسم النمو التلقائي. تستخدم طريقة الضعف الجنسي الإنزيمات ، في المقام الأول كولاجيناز I و dispase ، لتكسير الأنسجة إلى معلقات أحادية الخلية15,16. تستلزم طريقة OG ، أبسط وأسرع ، تقطيع شظايا اللب ووضعها مباشرة في لوحة مزرعة ، مما يسمح للخلايا بالنمو من الأنسجةالمزروعة 17. استخدم الباحثون وقارنوا كلتا التقنيتين لتقييم معدلات تكاثر الخلايا ، والحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية المعزولة ، والتمايز ، وتعبير علامات السطح18. يمكن أن يؤدي إنشاء وتوحيد بروتوكولات للحصول على DPSCs بكفاءة عالية وجذع إلى تمهيد الطريق لعلاجات فعالة وآمنة19. يشمل هذا البروتوكول استخراج DPSCs باستخدام الهضم الأنزيمي ، والمعالجة المعملية ، والحفظ ، وتمايز الخلايا مع تلطيخ لوني لتكوين الدهون ، وتكوين العظام ، وتكوين الغضروف.

يقدم البروتوكول الموضح في هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة ، بدءا من العزل الأولي للب الأسنان من السن ، متبوعا بزراعة وصيانة DPSCs في المختبر ، ويختتم بتوصيفها باستخدام علامات محددة للخلايا الجذعية (الشكل 1). كما تم وصف تقنيات تحفيز هذه الخلايا الجذعية في سلالات خلايا مختلفة ، مع تسليط الضوء على تعدد قدراتها.

Protocol

يتوافق البروتوكول المبين هنا مع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية (IRB ، مركز أبحاث Pushpagiri ، ولاية كيرالا). تم استخدام الأسنان المستخرجة وفقا للمعايير الأخلاقية لضمان نزاهة وكرامة وحقوق المشاركين. كان المشاركون الذين تم اختيارهم لهذه الدراسة من الأفراد الأصحاء الذين تقل أعمارهم عن 30 عاما والذين يحتاجون إلى قلع الأسنان لعلاج تقويم الأسنان. تم استبعاد أولئك الذين يعانون من تسوس الأسنان على نطاق واسع أو التهاب اللثة الحاد من الدراسة. تم جمع الأسنان اللبنية من الأطفال الذين يحتاجون إلى قلع الأسنان المحتجزة. كما تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص المشاركين في هذه الدراسة.

1. قلع ونقل الأسنان

  1. مجموعة من الأسنان اللبنية والدائمة
    1. اشرح للمشاركين الغرض من الإجراء والاستخدام المحتمل للأسنان المستخرجة لأغراض البحث.
    2. إجراء قلع الأسنان تحت التخدير الموضعي عن طريق إعطاء عامل مخدر بالقرب من السن المراد خلعه. على وجه التحديد ، تم حقن 1.75 مل من الليدوكائين الممزوج بالإبينفرين (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 200000 لهذه الدراسة. يفضل اختيار الأسنان التي لا تظهر تسوس الأسنان الشديد أو التهاب دواعم السن20,21.
  2. نقل الأسنان المقلوعة
    ملاحظة: يوصى بالعمل في ظروف معقمة لتجنب التلوث. ويشمل ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية ، مثل القفازات ومعطف المختبر ، والعمل في بيئة معقمة ، مثل غطاء التدفق الصفحي للمخاطر البيولوجية.
    1. بعد خلع السن ، اشطفه بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الدم والحطام الآخر. باستخدام ملقط معقم ومشرط ، قم بإزالة أي بقايا أنسجة رخوة متصلة بعناية من سطح السن (الشكل 2 أ).
    2. اغمر السن في محلول مطهر ، مثل 70٪ إيثانول ، لمدة 10 ثوان. بعد التطهير ، شطف السن مع برنامج تلفزيوني معقم لغسل أي مطهر متبقي.
    3. ضع السن في وعاء معقم يحتوي على وسيط النقل.
      ملاحظة: يتكون وسط النقل من Alpha-MEM ، وهو وسط استزراع تجاري مكمل بالمضادات الحيوية: 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين (انظر جدول المواد). زودت هذه الوسيلة العناصر الغذائية الأساسية للخلايا داخل السن المستخرج ، مما يضمن بقائها حتى المعالجة المختبرية. عملت المضادات الحيوية على تثبيط نمو البكتيريا.
    4. الحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية أثناء النقل لإبطاء أنشطة التمثيل الغذائي الخلوي وتأخير موت الخلايا. نقل السن إلى المختبر للخطوات التالية ، بما في ذلك معالجة وعزل الخلايا الجذعية لب الأسنان.

2. جمع أنسجة اللب

  1. قم بتأمين السن باستخدام ملقط الأسنان لضمان بقائه في مكانه أثناء العملية. استخدم قرصا ماسيا لقطع السن في قبضة الأسنان (انظر جدول المواد) المتصلة بمبرد ماء (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: الهدف هو كشف حجرة اللب دون التسبب في أضرار غير ضرورية لأنسجة اللب بداخلها.
  2. استخدم حفارة أسنان (انظر جدول المواد) لإزالة أنسجة اللب. تتيح هذه الأداة استخراج اللب دون إلحاق الضرر ، وبالتالي الحفاظ على صلاحية الخلايا الجذعية لب الأسنان (الشكل 2C).
  3. ضع الأنسجة التي تم الحصول عليها على طبق بتري الزجاجي. اغسل أنسجة اللب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات.

3. هضم أنسجة اللب وعزل الخلايا

  1. فرم الأنسجة والهضم
    1. باستخدام شفرة جراحية معقمة ، قم بفرم أنسجة اللب بعناية إلى أجزاء صغيرة (الشكل 2 د) وضعها في مطحنة أنسجة صغيرة مع برنامج تلفزيوني للحصول على خليط متجانس بدقة. تزيد هذه العملية من مساحة سطح الأنسجة ، مما يسهل عمل الإنزيم بشكل أكثر كفاءة أثناء الهضم.
    2. انقل شظايا الأنسجة المتجانسة المفرومة إلى أنبوب سعة 15 مل وهضمها إنزيميا باستخدام خليط من 3 مجم / مل كولاجيناز من النوع الأول و 4 مجم / مل ديسباز (انظر جدول المواد). تم إذابة هذه الإنزيمات في محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) لتحقيق التركيزات المطلوبة.
    3. احتضان أنسجة اللب في خليط الإنزيم (الخطوة 3.1.2) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتحييد الإنزيمات ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (الخطوة 3.2.1) لمزيد من الثقافة.
  2. الطرد المركزي وإعادة التعليق
    1. بعد الحضانة ، انقل الأنسجة المهضومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بتدويرها عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. تفصل هذه الخطوة الخلايا عن شظايا الأنسجة والإنزيمات المتبقية غير المهضومة. تخلص بعناية من الوسط الطافي ، مع التأكد من عدم إزعاج حبيبات الخلية في أسفل الأنبوب.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط استزراع جديد. يوفر هذا الوسط العناصر الغذائية والبيئة اللازمة للخلايا المعزولة للبقاء والتكاثر.

4. ثقافة الخلية

  1. تصفيح وحضانة الخلايا
    1. انقل الخلايا المعاد تعليقها بعناية إلى دورق مزرعة 25 سم².
      ملاحظة: يتم نقل جميع المواد من لب واحد إلى دورق واحد 25 سم2 ثقافة الخلية. يضمن حجم الوسائط من 5-7 مل تغطية كافية وتوافر المغذيات للخلايا. تأكد من أن وسط الاستزراع ل DPSCs هو وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ -20٪ (FBS) (انظر جدول المواد) لتوفير عوامل النمو اللازمة. علاوة على ذلك ، استكمل الوسط ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين لمنع التلوث البكتيري. تأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء القارورة لتعزيز النمو المتجانس.
    2. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  2. التغيير المتوسط ومراقبة التقاء
    1. قم بتغيير وسط الاستزراع كل 2-3 أيام لتوفير العناصر الغذائية الطازجة وإزالة النفايات الأيضية. للقيام بذلك ، استنشق بعناية الوسط القديم باستخدام ماصة مصلية معقمة واستبدلها بوسيط جديد.
    2. راقب بانتظام ثقافة الخلية تحت المجهر لتتبع نمو الخلايا والتحقق من أي علامات تلوث.
    3. استمر في هذه العملية حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، وهي النقطة التي تغطي فيها الخلايا معظم مساحة سطح القارورة ولكنها ليست مزدحمة بشكل مفرط.
  3. التربسين الخلوي وتمريره أو تجميده
    1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، قم بإزالة وسط المزرعة واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الخلايا المتوسطة المتبقية وغير الملتصقة.
    2. أضف محلول 0.25٪ trypsin-EDTA إلى الدورق لفصل الخلايا عن سطح القارورة. احتضان لمدة 2-5 دقائق على 37 درجة مئوية حتى ترفع الخلايا.
    3. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع ، ثم قم بسحب تعليق الخلية برفق لأعلى ولأسفل لضمان انفصال الخلية بالكامل.
    4. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
    5. أعد تعليق الخلايا في وسط استزراع جديد وإما إعادة طلائها (مرور) لمزيد من النمو أو تجميدها لاستخدامها في المستقبل. عند التجميد ، استخدم وسيط تجميد يحتوي على مادة واقية من البرودة ، مثل DMSO ، لحماية الخلايا من التلف أثناء التجميد.

5. توصيف DPSCs

  1. تحليل التدفق الخلوي
    1. لتأكيد طبيعة الخلايا الجذعية الوسيطة للخلايا المعزولة ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي22,23. في البداية ، التربسين وجمع الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4.3.
    2. تحديد صلاحية الخلية من خلال تقنية استبعاد صبغة التريبان. قم بإجراء التحليل باستخدام محلل صلاحية الخلية (انظر جدول المواد)خلال المقطعين 2 و 8. إجراء تحليل النمط الظاهري عبر مقياس التدفق الخلويخلال الممرات 3 و 7.
    3. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي لإزالة الأجسام المضادة الزائدة وتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) ، و 1٪ -2٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 0.1٪ أزيد صوديوم (NaN3). يمنع FBS أو BSA الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة ، بينما يعمل أزيد الصوديوم كمادة حافظة. يجب أن تعبر نسبة عالية من الخلايا عن علامات الخلايا الجذعية الوسيطة وتفتقر إلى علامات المكونة للدم ، مما يؤكد هويتها على أنها DPSCs24.
    4. افصل DPSCs وقم بتلطيخها بالأجسام المضادة المناعية لتحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: يعتمد اختيار علامات تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على الإجماع الذي أنشأته الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) ، والذي ينص على أن MSCs يجب أن تعبر عن CD105 و CD73 و CD90 ، وتفتقر إلى التعبير عن CD45 أو CD34 أو CD14 أو CD11b أو CD79a أو CD19 و HLA من الفئةII 25. تستخدم هذه العلامات بشكل شائع في الدراسات التي تبحث في الخلايا الجذعية لب الأسنان26. يمكن أن تختلف تركيزات الأجسام المضادة للتلطيخ اعتمادا على الجسم المضاد المحدد المستخدم ، ويوصى باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) لتخفيفات الأجسام المضادة وظروف الحضانة25.
    5. وضع معايير التصنيف27,28 للتعبير عن علامات CD كما ذكر: أقل من 10٪ ، لا يوجد تعبير ؛ بين 11٪ و 40٪ ، تعبير منخفض ؛ نطاق من 41٪ إلى 70٪ ، تعبير معتدل ؛ فوق 71٪ ، تعبير عالي.
    6. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من عدم وجود علامات المكونة للدم عن طريق احتضان حصص خلية منفصلة مع الأجسام المضادة ضد CD34 و CD45.

6. تمايز متعدد السلالات

ملاحظة: تحدد الخطوات التالية بروتوكولات التمايز العظمي والشحمي والغضروفي للخلايا الجذعية السنية. ابدأ بزرع الثقافات بكثافة 1 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المغلفة بالفبرونيكتين مع وسط كامل (CM). راقب نمو الخلايا حتى يتم تحقيق التقاء 80٪ -90٪ قبل بدء بروتوكول التمايز المطلوب. لتقييم إمكانات التمايز متعدد السلالات ل DPSCs ، ابدأ عملية التمايز نحو بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية عن طريق زرع الخلايا في 24 صفيحة جيدة واستزراعتها في وسائط التمايز المناسبة.

  1. التمايز العظمي
    1. ابدأ بزراعة DPSCs في وسط نمو منتظم في ظل الظروف القياسية حتى تصل إلى التقاء 70٪ -80٪.
    2. قم بإزالة وسط النمو من الخلايا ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS. أضف وسط التمايز العظمي (ODM) إلى الخلايا.
      ملاحظة: يتكون ODM من ألفا الحد الأدنى من الوسط الأساسي (α-MEM) المكمل ب 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 10 مللي مول بيتا جليسيروفوسفات ، و 100 نانومتر ديكساميثازون (انظر جدول المواد).
    3. احتضان الخلايا في الوسط العظمي عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تغيير الوسط العظمي كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: بعد 14 إلى 21 يوما ، يجب أن تكون DPSCs متمايزة إلى خلايا تشبه بانيات العظم. يمكن تأكيد ذلك عن طريق التحقق من وجود زيادة في التعبير عن علامات خاصة ببانيات العظم ، مثل الفوسفاتيز القلوي ، أو باستخدام تقنيات التلوين للكشف عن المصفوفة المعدنية ، مثل تلطيخ Alizarin Red S.
    4. إصلاح الخلايا عن طريق احتضانها مع 70 ٪ من الإيثانول الجليد البارد لمدة 1 ساعة عند -20 درجة مئوية.
    5. قم بتلطيخ الخلايا الثابتة بمحلول تلطيخ 40 نانومتر Alizarin Red S (درجة الحموضة 4.2) في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10-15 دقيقة. تصور التلوين تحت المجهر لتأكيد التمايز العظمي (الشكل 3). تأكيد التمايز عن طريق تلطيخ الخلايا مع Alizarin Red S ، والذي يحدد رواسب الكالسيوم التي تدل على التمعدن29,30.
  2. التمايز الأديبوجيني
    1. كما هو مفصل في القسم السابق ، استزرع DPSCs في ظل الظروف القياسية في جو مرطب مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1x PBS. استبدل الوسط المغسول بوسط تمايز شحمي. يتكون هذا الوسط بشكل عام من DMEM ، 10٪ FBS ، 10 ميكروغرام / مل أنسولين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 200 ميكرومتر إندوميتاسين ، و 0.5 مللي متر IBMX (انظر جدول المواد).
    3. تغيير وسط التمايز كل 3-4 أيام. بعد حوالي 3 أسابيع ، اغسل DPSCs المتمايزة للدهون باستخدام PBS وقم بإصلاحها باستخدام 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بتلطيخ الخلايا الثابتة بالزيت الأحمر O (انظر جدول المواد) لتصور تراكم قطرات الدهون (الشكل 4). لمزيد من تأكيد التمايز الدهني ، قم بإجراء تحليل التعبير الجيني للعلامات الدهنية مثل غاما مستقبلات البيروكسيسوم المنشطة (PPARγ) والأديبونيكتين31,32.
  3. التمايز الغضروفي
    1. يتم استخدام مزارع DPSCs التي يتم الحفاظ عليها في جو مرطب مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية للتمايز الغضروفي. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1x PBS. استبدل الوسط المغسول بوسط تمايز غضروفي ، والذي يحتوي عادة على نسبة عالية من الجلوكوز في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، و 1٪ ITS ، و 100 نانومتر ديكساميثازون ، و 50 ميكروغرام / مل أسكوربات -2-فوسفات ، و 40 ميكروغرام / مل من البرولين ، و 10 نانوغرام / مل تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGF-β3) (انظر جدول المواد).
    3. الحفاظ على الخلايا في وسط التمايز الغضروفي ، وتغيير الوسط كل 2-3 أيام. بعد حوالي ثلاثة أسابيع ، يجب أن تكون DPSCs قد تمايزت إلى خلايا تشبه الخلايا الغضروفية.
    4. إصلاح الخلايا عن طريق احتضانها مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق الألسياني (انظر جدول المواد) وتصورها تحت المجهر لتأكيد التمايز الغضروفي (الشكل 5).
    5. تأكد من تمايز DPSCs إلى خلايا غضروفية باستخدام تقنيات مثل تلطيخ Alcian Blue للبروتيوغليكان أو تحليل التعبير الجيني للعلامات الغضروفية مثل aggrecan و SOX9 والكولاجين من النوع الثاني33,34.

النتائج

أسفر التنفيذ الناجح للبروتوكول المحدد عن خلايا جذعية لب الأسنان (DPSCs) قادرة على التمايز متعدد السلالات ، مما يدل على تعدد قدراتها.

مقايسات الجدوى
تم تقييم جدوى DPSCs باستخدام مقايسة استبعاد Trypan Blue في نقاط زمنية مختلفة. تظهر النتائج قابلية عالية باستمرار (أكبر من 95٪) ?...

Discussion

يحدد البروتوكول عزل وثقافة وتوصيف الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من الأسنان اللبنية والدائمة البشرية. يتضمن وصفا لتخزين وتكاثر هذه الخلايا ، بالإضافة إلى تقييم إمكانية تمايزها في المختبر إلى بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية35.

أظهر Chen et <...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور ماثيو مازافانشيريل ، مدير ورئيس مركز أبحاث بوشباغيري في ثيروفالا ، لدعمه في توثيق الإجراءات في مركز الأبحاث.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

References

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891 (2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175 (2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. . Regenerative medicine-from protocol to patient. , 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572 (2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945 (2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392 (2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372 (2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114 (2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854 (2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434 (2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -. G., George, J. -. M., Sweety, V. -. K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906 (2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89 (2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531 (2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved