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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo enfatizza l'estrazione, la coltura e la conservazione di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale attraverso la digestione enzimatica. Inoltre, dimostra il loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti, evidenziando l'importanza della precisione e della coerenza nel processo.

Abstract

Nell'ambito della medicina rigenerativa e delle applicazioni terapeutiche, la ricerca sulle cellule staminali sta rapidamente guadagnando terreno. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC), che sono presenti sia nei denti decidui che in quelli permanenti, sono emerse come una fonte vitale di cellule staminali grazie alla loro accessibilità, adattabilità e capacità di differenziazione innate. Le DPSC offrono un serbatoio abbondante e prontamente disponibile di cellule staminali mesenchimali, mostrando una versatilità e un potenziale impressionanti, in particolare per scopi rigenerativi. Nonostante le loro promesse, l'ostacolo principale risiede nell'isolare e caratterizzare efficacemente le DPSC, data la loro rappresentazione come una frazione minuscola all'interno delle cellule della polpa dentale. Altrettanto cruciale è la corretta conservazione di questa inestimabile risorsa cellulare. I due metodi predominanti per l'isolamento della DPSC sono la digestione enzimatica (ED) e la crescita da espianti di tessuto (OG), spesso indicata come crescita spontanea. Questo protocollo si concentra principalmente sull'approccio di digestione enzimatica per l'isolamento del DPSC, descrivendo in dettaglio le fasi che comprendono l'estrazione, l'elaborazione in laboratorio e la conservazione delle cellule. Oltre all'estrazione e alla conservazione, il protocollo approfondisce l'abilità di differenziazione delle DPSC. In particolare, delinea le procedure impiegate per indurre queste cellule staminali a differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti, mostrando i loro attributi multipotenti. Il successivo utilizzo di tecniche di colorazione colorimetrica facilita la visualizzazione accurata e la conferma del successo della differenziazione, convalidando così il calibro e la funzionalità dei DPSC isolati. Questo protocollo completo funziona come un modello che comprende l'intero spettro dell'estrazione, coltivazione, conservazione e caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale. Sottolinea il notevole potenziale dei DPSC, spingendo in avanti l'esplorazione delle cellule staminali e mantenendo la promessa di future scoperte rigenerative e terapeutiche.

Introduzione

La ricerca sulle cellule staminali è fiorita nella scienza biomedica grazie alle sue promettenti applicazioni nella medicina rigenerativa e nell'ingegneria tissutale. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC), derivate dal tessuto pulpare dei denti decidui umani e permanenti, hanno suscitato un notevole interesse come fonte di cellule staminali grazie alla loro pronta disponibilità e capacità multipotente 1,2. Queste cellule hanno il potenziale per differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui adipociti, osteoblasti e condrociti, come confermato da numerosi studi3.

Negli ultimi decenni, la ricerca e le applicazioni terapeutiche delle cellule staminali sono aumentate. Il potenziale espansivo delle cellule staminali richiede una diversificazione delle fonti da cui sono ottenute. Diversi fattori influenzano l'efficienza, la vitalità e la staminalità delle cellule scelte. Nonostante l'esistenza di vari serbatoi noti di cellule staminali, come il midollo osseo e i tessuti adiposi, le procedure invasive, la morbilità del sito e le preoccupazioni etiche legate a queste fonti spesso ne limitano l'esplorazione 4,5. Tra le varie fonti di cellule staminali, le cellule staminali dentali hanno attirato l'attenzione grazie alla loro facile accessibilità, all'elevata plasticità e alle diverse potenziali applicazioni. Le cellule staminali della polpa dentale umana, in particolare, sono state ampiamente studiate per le loro prospettive terapeutiche6. I denti, comunemente scartati come rifiuti medici, contengono una ricchezza di cellule staminali mesenchimali7. La salvaguardia di questo prezioso pool di cellule staminali richiede sforzi collettivi da parte di pazienti, dentisti e medici per garantire che queste risorse non vengano sprecate, rendendo ogni cellula staminale della polpa dentale disponibile per future esigenze rigenerative.

Le cellule staminali derivate dalla polpa dentale, come le cellule staminali della polpa dentale adulta umana (DPSC) e le cellule staminali dei denti decidui umani esfoliati (SHED), si trovano nella nicchia perivascolare della polpa dentale. Si ritiene che queste cellule provengano da cellule della cresta neurale cranica e mostrino marcatori precoci sia per le cellule staminali mesenchimali (MSC) che per le cellule staminali neuroectodermiche. DPSC e SHED hanno dimostrato multipotenza e la capacità di rigenerare diversi tipi di tessuto8.

Le potenziali fonti di cellule staminali dentali comprendono denti decidui sani e permanenti. Le cellule staminali costituiscono solo circa l'1% della popolazione cellulare totale nella polpa, evidenziando l'importanza di tecniche efficaci di isolamento ed espansione9. Di conseguenza, l'estrazione e l'espansione di queste cellule staminali sono passaggi fondamentali nell'isolamento DPSC10. I denti estratti o esfoliati devono essere conservati in un mezzo di trasporto ricco di sostanze nutritive, come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina tamponata con Hanks (HBSS).

L'ottenimento della polpa dentale può essere ottenuto attraverso vari metodi, a seconda del tipo di dente 7,11. Per i denti decidui con radici riassorbite, l'estrazione può essere eseguita attraverso l'apice della radice. Allo stesso modo, le brocce spinate sterili possono essere utilizzate per ottenere polpa da denti permanenti con un apice aperto immaturo. In caso di denti permanenti con radici completamente sviluppate, l'accesso alla camera pulpare comporta la separazione della corona dentale dalla radice. Ciò si ottiene tagliando il dente utilizzando un disco diamantato alla giunzione dello smalto cementizio. Questa incisione espone la camera pulpare, consentendo il recupero del tessuto pulpare 12,13,14.

Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) possono essere isolate attraverso la digestione enzimatica (DE) o la crescita da espianti di tessuto (OG), nota anche come crescita spontanea. Il metodo ED impiega enzimi, principalmente collagenasi I e dispasi, per scomporre il tessuto in sospensioni unicellulari15,16. Il metodo OG, più semplice e veloce, prevede il taglio dei frammenti di polpa e il loro inserimento diretto in una piastra di coltura, consentendo alle cellule di crescere dagli espianti di tessuto17. I ricercatori hanno utilizzato e confrontato entrambe le tecniche per valutare i tassi di proliferazione cellulare, la conservazione delle proprietà delle cellule staminali isolate, la differenziazione e l'espressione dei marcatori di superficie18. La definizione e la standardizzazione di protocolli per l'acquisizione di DPSC con elevata efficienza e staminalità può aprire la strada a terapie efficaci e sicure19. Questo protocollo comprende l'estrazione di DPSC mediante digestione enzimatica, elaborazione in laboratorio, conservazione e differenziazione cellulare con colorazione colorimetrica per adipogenesi, osteogenesi e condrogenesi.

Il protocollo descritto in questo articolo presenta una procedura passo-passo, che inizia con l'isolamento iniziale della polpa dentale dal dente, seguita dalla coltura e dal mantenimento delle DPSC in laboratorio, e si conclude con la loro caratterizzazione utilizzando specifici marcatori di cellule staminali (Figura 1). Vengono inoltre descritte le tecniche per indurre queste cellule staminali in diverse linee cellulari, evidenziandone la multipotenza.

Protocollo

Il protocollo qui delineato è conforme alle linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). L'uso dei denti estratti è stato condotto seguendo standard etici per garantire l'integrità, la dignità e i diritti dei partecipanti. I partecipanti selezionati per questo studio erano individui sani di età inferiore ai 30 anni che necessitavano di estrazione dentale per il trattamento ortodontico. Quelli con carie dentale estesa o grave parodontite sono stati esclusi dallo studio. I denti decidui sono stati raccolti dai bambini che hanno richiesto l'estrazione dei denti trattenuti. Il consenso informato scritto è stato ottenuto anche dai soggetti coinvolti in questo studio.

1. Estrazione e trasporto dei denti

  1. Raccolta di denti decidui e permanenti
    1. Spiegare ai partecipanti lo scopo della procedura e il potenziale utilizzo dei denti estratti per scopi di ricerca.
    2. Eseguire l'estrazione dei denti in anestesia locale somministrando un agente anestetico in prossimità del dente da estrarre. In particolare, per questo studio sono stati iniettati 1,75 ml di lidocaina miscelata con epinefrina (vedi Tabella dei materiali) in rapporto 1:200.000. È preferibile selezionare denti che non presentino carie dentale grave o parodontite20,21.
  2. Trasporto dei denti estratti
    NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni asettiche per evitare contaminazioni. Ciò include l'uso di dispositivi di protezione individuale, come guanti e camice da laboratorio, e il lavoro in un ambiente sterile, come un cappuccio a flusso laminare a rischio biologico.
    1. Dopo che il dente è stato estratto, sciacquarlo con una soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il sangue e altri detriti. Utilizzando una pinza sterile e un bisturi, rimuovere con cura eventuali residui di tessuto molle attaccati dalla superficie del dente (Figura 2A).
    2. Immergere il dente in una soluzione disinfettante, come etanolo al 70%, per 10 s. Dopo la disinfezione, sciacquare il dente con PBS sterile per lavare via eventuali residui di disinfettante.
    3. Mettere il dente in un contenitore sterile contenente il mezzo di trasporto.
      NOTA: Il mezzo di trasporto consisteva in Alpha-MEM, un terreno di coltura commerciale integrato con antibiotici: 100 U/mL di penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali). Questo mezzo forniva nutrienti essenziali alle cellule all'interno del dente estratto, garantendone la sopravvivenza fino all'elaborazione in laboratorio. Gli antibiotici servivano a inibire la crescita batterica.
    4. Mantenere una temperatura di 4 °C durante il trasporto per rallentare le attività metaboliche cellulari e ritardare la morte cellulare. Trasporta il dente in laboratorio per le fasi successive, tra cui l'elaborazione e l'isolamento delle cellule staminali della polpa dentale.

2. Raccolta del tessuto pulpare

  1. Fissare il dente utilizzando una pinza dentale per assicurarsi che rimanga in posizione durante la procedura. Utilizzare un disco diamantato per tagliare il dente in un manipolo dentale (vedere Tabella dei materiali) collegato a un refrigerante ad acqua (Figura 2B).
    NOTA: L'obiettivo è esporre la camera pulpare senza causare danni inutili al tessuto pulpare all'interno.
  2. Utilizzare un escavatore dentale (vedi Tabella dei materiali) per rimuovere il tessuto pulpare. Questo strumento consente l'estrazione della polpa senza infliggere danni, preservando così la vitalità delle cellule staminali della polpa dentale (Figura 2C).
  3. Posizionare il tessuto ottenuto su una capsula di Petri di vetro. Lavare il tessuto pulpare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato.

3. Digestione del tessuto pulpare e isolamento cellulare

  1. Macinazione e digestione dei tessuti
    1. Con una lama chirurgica sterile, tritare accuratamente il tessuto pulpare in piccoli frammenti (Figura 2D) e posizionarlo in un mini trituratore di tessuti con PBS per ottenere una miscela finemente omogeneizzata. Questo processo aumenta la superficie del tessuto, facilitando un'azione enzimatica più efficiente durante la digestione.
    2. Trasferire i frammenti di tessuto omogeneo tritati in una provetta da 15 mL e digerire enzimaticamente utilizzando una miscela di 3 mg/mL di collagenasi di tipo I e 4 mg/mL di dispasi (vedere la Tabella dei materiali). Questi enzimi sono stati disciolti nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per ottenere le concentrazioni desiderate.
    3. Incubare il tessuto pulpare nella miscela enzimatica (punto 3.1.2) per circa 2 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, neutralizzare gli enzimi e raccogliere le cellule mediante centrifugazione (passaggio 3.2.1) per un'ulteriore coltura.
  2. Centrifugazione e risospensione
    1. Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto digerito in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Questo passaggio separa le cellule dai frammenti di tessuto rimanenti e dagli enzimi non digeriti. Eliminare con cura il mezzo surnatante, assicurandosi di non disturbare il pellet della cella sul fondo della provetta.
    2. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura fresco. Questo mezzo fornisce i nutrienti e l'ambiente necessari per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule isolate.

4. Coltura cellulare

  1. Placcatura e incubazione delle cellule
    1. Trasferire con cura le cellule risospese in un pallone di coltura di 25 cm².
      NOTA: Tutto il materiale di una singola polpa viene trasferito in un unico pallone per colture cellulari da 25 cm2 . Un volume del terreno di 5-7 mL garantisce una copertura e una disponibilità di nutrienti sufficienti per le cellule. Assicurarsi che il terreno di coltura per i DPSC sia il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10%-20% di siero fetale bovino (FBS) (vedere la Tabella dei materiali) per fornire i fattori di crescita necessari. Inoltre, integrare il terreno con l'1% di penicillina/streptomicina per prevenire la contaminazione batterica. Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente in tutto il pallone per favorire una crescita omogenea.
    2. Incubare il matraccio a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
  2. Variazione del fluido e confluenza di monitoraggio
    1. Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni per fornire nutrienti freschi e rimuovere le scorie metaboliche. Per fare ciò, aspirare con cura il vecchio terreno utilizzando una pipetta sierologica sterile e sostituirlo con un terreno nuovo.
    2. Monitorare regolarmente la coltura cellulare al microscopio per monitorare la crescita delle cellule e verificare la presenza di eventuali segni di contaminazione.
    3. Continuare questo processo fino a quando le celle raggiungono l'80%-90% di confluenza, il punto in cui le celle coprono la maggior parte della superficie del pallone ma non sono eccessivamente affollate.
  3. Tripsinizzazione e passaggio o congelamento cellulare
    1. Una volta che le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il terreno residuo e le cellule non aderenti.
    2. Aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% al matraccio per staccare le cellule dalla superficie del pallone. Incubare per 2-5 minuti a 37 °C fino al distacco delle cellule.
    3. Neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura, quindi pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per garantire il completo distacco delle cellule.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
    5. Risospendere le cellule in un terreno di coltura fresco e ripiastarle (passaggio) per un'ulteriore crescita o congelarle per un uso futuro. Durante il congelamento, utilizzare un mezzo di congelamento che contenga un crioprotettore, come il DMSO, per proteggere le cellule dai danni durante il congelamento.

5. Caratterizzazione dei DPSC

  1. Analisi di citometria a flusso
    1. Per confermare la natura delle cellule staminali mesenchimali delle cellule isolate, eseguire l'analisi di citometria a flusso22,23. Inizialmente, tripsinizzare e raccogliere le cellule come descritto nel passaggio 4.3.
    2. Determinare la vitalità cellulare mediante la tecnica di esclusione del colorante tripano. Eseguire l'analisi utilizzando un analizzatore di vitalità cellulare (vedi Tabella dei materiali) durante il 2° e l'8° passaggio. Eseguire l'analisi fenotipica tramite un citometro a flusso durante il 3° e il 7° passaggio.
    3. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in un tampone per citometria a flusso per rimuovere gli anticorpi in eccesso e analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso.
      NOTA: Il tampone per citometria a flusso è composto da soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS), siero fetale bovino (FBS) all'1%-2% e sodio azide allo 0,1% (NaN3). L'FBS o BSA blocca il legame aspecifico degli anticorpi, mentre l'azoturo di sodio agisce come conservante. Un'alta percentuale di cellule dovrebbe esprimere i marcatori delle cellule staminali mesenchimali e mancare dei marcatori ematopoietici, confermando la loro identità come DPSC24.
    4. Staccare le DPSC e colorarle con anticorpi in immunofluorescenza per l'analisi della citometria a flusso.
      NOTA: La selezione dei marcatori per l'analisi della citometria a flusso delle cellule staminali mesenchimali (MSC) si basa sul consenso stabilito dalla Società Internazionale di Terapia Cellulare (ISCT), che afferma che le MSC dovrebbero esprimere CD105, CD73 e CD90 e non hanno l'espressione di CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19 e HLA di classe II25. Questi marcatori sono comunemente usati negli studi che studiano le cellule staminali della polpa dentale26. Le concentrazioni di anticorpi per la colorazione possono variare a seconda dell'anticorpo specifico utilizzato e si raccomanda di seguire le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali) per le diluizioni degli anticorpi e le condizioni di incubazione25.
    5. Stabilire i criteri di classificazione 27,28 per l'espressione dei marcatori CD come detto: meno del 10%, nessuna espressione; tra l'11% e il 40%, bassa espressione; un intervallo compreso tra il 41% e il 70%, espressione moderata; superiore al 71%, alta espressione.
    6. Inoltre, confermare l'assenza di marcatori ematopoietici incubando un'aliquota cellulare separata con anticorpi contro CD34 e CD45.

6. Differenziazione multilineage

NOTA: I seguenti passaggi delineano i protocolli per la differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica delle cellule staminali dentali. Iniziare seminando le colture a una densità di 1 x 105 cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale rivestita di fibronectina con terreno completo (CM). Monitorare la crescita cellulare fino al raggiungimento della confluenza dell'80%-90% prima di avviare il protocollo di differenziazione desiderato. Per valutare il potenziale di differenziazione multilineage delle DPSC, avviare il processo di differenziazione verso osteoblasti, adipociti e condrociti seminando le cellule in piastre a 24 pozzetti e coltivandole in terreni di differenziazione appropriati.

  1. Differenziamento osteogenico
    1. Inizia coltivando i DPSC in un terreno di coltura regolare in condizioni standard fino a raggiungere la confluenza del 70%-80%.
    2. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, quindi lavare le cellule una volta con 1x PBS. Aggiungere il mezzo di differenziazione osteogenico (ODM) alle cellule.
      NOTA: L'ODM è costituito da Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) integrato con il 10% di FBS, 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 mM di beta-glicerofosfato e 100 nM di desametasone (vedi Tabella dei materiali).
    3. Incubare le cellule nel terreno osteogenico a 37 °C con CO2 al 5%. Cambiare il terreno osteogenico ogni 2-3 giorni.
      NOTA: Dopo 14-21 giorni, le DPSC dovrebbero essersi differenziate in cellule simili agli osteoblasti. Ciò può essere confermato controllando un aumento dell'espressione di marcatori specifici per gli osteoblasti, come la fosfatasi alcalina, o utilizzando tecniche di colorazione per rilevare la matrice mineralizzata, come la colorazione S rosso di alizarina.
    4. Fissare le cellule incubandole con etanolo ghiacciato al 70% per 1 ora a -20 °C.
    5. Colorare le cellule fissate con una soluzione colorante 40 nM di Alizarina Rosso S (pH 4,2) a temperatura ambiente al buio per 10-15 minuti. Visualizzare la colorazione al microscopio per confermare la differenziazione osteogenica (Figura 3). Confermare la differenziazione colorando le cellule con Alizarina Red S, che identifica i depositi di calcio indicativi di mineralizzazione29,30.
  2. Differenziazione adipogenica
    1. Come descritto nella sezione precedente, i DPSC vengono coltivati in condizioni standard in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Passaggio delle celle quando raggiungono circa il 70%-80% di confluenza.
    2. Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Sostituire il mezzo di derivazione lavato con un mezzo di differenziazione adipogenico. Questo terreno è generalmente costituito da DMEM, 10% FBS, 10 μg/mL di insulina, 1 μM di desametasone, 200 μM di indometacina e 0,5 mM di IBMX (vedi Tabella dei materiali).
    3. Cambiare il mezzo di differenziazione ogni 3-4 giorni. Dopo circa 3 settimane, lavare le DPSC adipogenico-differenziate con PBS e fissarle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
    4. Colorare le cellule fissate con Oil Red O (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare l'accumulo di goccioline lipidiche (Figura 4). Per confermare ulteriormente la differenziazione adipogenica, eseguire l'analisi dell'espressione genica di marcatori adipogenici come il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ) e l'adiponectina31,32.
  3. Differenziazione condrogenica
    1. Per la differenziazione condrogenica vengono utilizzate colture di DPSC mantenute in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Passaggio delle celle quando raggiungono circa il 70%-80% di confluenza.
    2. Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Sostituire il terreno di derivazione condrogenico, che in genere contiene il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, l'1% di ITS, 100 nM di desametasone, 50 μg/mL di ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL di prolina e 10 ng/mL di Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) (vedere la Tabella dei materiali).
    3. Mantenere le cellule nel mezzo di differenziazione condrogenico, cambiando il terreno ogni 2-3 giorni. Dopo circa tre settimane, le DPSC dovrebbero essersi differenziate in cellule simili ai condrociti.
    4. Fissare le cellule incubandole con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, colorare le cellule con Alcian Blue (vedi Tabella dei materiali) e visualizzarle al microscopio per confermare la differenziazione condrogenica (Figura 5).
    5. Confermare la differenziazione delle DPSC in condrociti utilizzando tecniche come la colorazione con Alcian Blue per i proteoglicani o l'analisi dell'espressione genica di marcatori condrogenici come l'aggrecano, SOX9 e il collagene di tipoII 33,34.

Risultati

L'esecuzione con successo del protocollo delineato ha prodotto cellule staminali della polpa dentale (DPSC) in grado di differenziare più lignaggi, dimostrando la loro multipotenza.

Saggi di vitalità
La vitalità dei DPSC è stata valutata utilizzando un test di esclusione del Trypan Blue in vari punti temporali. I risultati mostrano una vitalità costantemente elevata (superiore al 95%) durante tutto il periodo di coltura, dimostrando la robustezza del nostro protocollo ...

Discussione

Il protocollo delinea l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) da denti decidui e permanenti umani. Include una descrizione dell'immagazzinamento e della proliferazione di queste cellule, nonché la valutazione del loro potenziale di differenziazione in vitro in osteoblasti, adipociti e condrociti35.

Chen et al.36 hanno dimostrato che le cellule staminali d...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati al Dr. Mathew Mazhavancheril, direttore e capo del Centro di ricerca Pushpagiri a Thiruvalla, per il suo supporto nella documentazione delle procedure presso il Centro di ricerca.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

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