JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, multipotent kök hücrelerin enzimatik sindirim yoluyla diş pulpasından ekstraksiyonunu, kültürünü ve korunmasını vurgular. Ek olarak, osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere farklılaşma potansiyellerini göstererek süreçte hassasiyet ve tutarlılığın önemini vurgular.

Özet

Rejeneratif tıp ve terapötik uygulamalar alanında, kök hücre araştırmaları hızla ilgi görmektedir. Hem süt dişlerinde hem de kalıcı dişlerde bulunan pulpa kök hücreleri (DPSC'ler), erişilebilirlikleri, uyum sağlayabilmeleri ve doğuştan gelen farklılaşma yetenekleri nedeniyle hayati bir kök hücre kaynağı olarak ortaya çıkmıştır. DPSC'ler, özellikle rejeneratif amaçlar için etkileyici çok yönlülük ve potansiyel sergileyen, hazır ve bol miktarda bulunan bir mezenkimal kök hücre rezervuarı sunar. Vaatlerine rağmen, ana engel, diş pulpası hücreleri içinde çok küçük bir fraksiyon olarak temsil edildikleri göz önüne alındığında, DPSC'lerin etkili bir şekilde izole edilmesi ve karakterize edilmesinde yatmaktadır. Aynı derecede önemli olan, bu paha biçilmez hücresel kaynağın uygun şekilde korunmasıdır. DPSC izolasyonu için iki baskın yöntem, enzimatik sindirim (ED) ve genellikle spontan büyüme olarak adlandırılan doku eksplantlarından (OG) büyümedir. Bu protokol, öncelikle DPSC izolasyonu için enzimatik sindirim yaklaşımına odaklanır ve ekstraksiyon, laboratuvar içi işleme ve hücre korumayı kapsayan adımları karmaşık bir şekilde detaylandırır. Ekstraksiyon ve korumanın ötesinde, protokol DPSC'lerin farklılaşma becerisini araştırıyor. Spesifik olarak, bu kök hücreleri adipositlere, osteoblastlara ve kondrositlere farklılaşmaya teşvik etmek için kullanılan prosedürleri ana hatlarıyla belirtir ve multipotent özelliklerini sergiler. Kolorimetrik boyama tekniklerinin daha sonra kullanılması, başarılı farklılaşmanın doğru bir şekilde görselleştirilmesini ve onaylanmasını kolaylaştırır, böylece izole edilmiş DPSC'lerin kalibresini ve işlevselliğini doğrular. Bu kapsamlı protokol, diş pulpası kök hücre ekstraksiyonu, yetiştirilmesi, korunması ve karakterizasyonunun tüm spektrumunu kapsayan bir plan işlevi görür. DPSC'lerin barındırdığı önemli potansiyelin altını çiziyor, kök hücre araştırmalarını ilerletiyor ve gelecekteki rejeneratif ve terapötik atılımlar için umut vaat ediyor.

Giriş

Kök hücre araştırmaları, rejeneratif tıp ve doku mühendisliğindeki umut verici uygulamaları nedeniyle biyomedikal biliminde gelişmiştir. Hem insan süt dişlerinin hem de kalıcı dişlerinin pulpa dokusundan elde edilen pulpa kök hücreleri (DPSC'ler), hazır bulunmaları ve multipotent kapasiteleri nedeniyle kök hücre kaynağı olarak büyük ilgi görmüştür 1,2. Bu hücreler, çok sayıda çalışma ile onaylandığı gibi, adipositler, osteoblastlar ve kondrositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahiptir3.

Son birkaç on yılda, kök hücrelerin araştırma ve terapötik uygulamaları artmıştır. Kök hücrelerin geniş potansiyeli, elde edildikleri kaynakları çeşitlendirmeyi gerektirir. Seçilen hücrelerin verimliliğini, canlılığını ve köklülüğünü etkileyen çeşitli faktörler vardır. Kemik iliği ve yağ dokuları gibi bilinen çeşitli kök hücre rezervuarlarının varlığına rağmen, bu kaynaklara bağlı invaziv prosedürler, saha morbiditesi ve etik kaygılar sıklıkla araştırılmalarını sınırlar 4,5. Çeşitli kök hücre kaynakları arasında, dental kök hücreler kolay erişilebilirlikleri, yüksek plastisiteleri ve çeşitli potansiyel uygulamaları nedeniyle dikkat çekmiştir. Özellikle insan diş pulpası kök hücreleri, terapötik beklentileri için kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır6. Genellikle tıbbi atık olarak atılan dişler, çok sayıda mezenkimal kök hücre içerir7. Bu değerli kök hücre havuzunu korumak, bu kaynakların boşa harcanmamasını sağlamak için hastaların, diş hekimlerinin ve doktorların ortak çabalarını gerektirir ve her bir diş pulpası kök hücresini gelecekteki rejeneratif gereksinimler için kullanılabilir hale getirir.

İnsan yetişkin diş pulpası kök hücreleri (DPSC'ler) ve pul pul dökülmüş insan süt dişlerinden (SHED) elde edilen kök hücreler gibi diş pulpasından türetilmiş kök hücreler, diş pulpasının perivasküler nişinde bulunur. Bu hücrelerin kraniyal nöral krest hücrelerinden kaynaklandığına ve hem mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) hem de nöroektodermal kök hücreler için erken belirteçler sergilediğine inanılmaktadır. DPSC'ler ve SHED'ler, çok potansiyelli ve çeşitli doku tiplerini yeniden oluşturma yeteneği göstermiştir8.

Dental kök hücrelerin potansiyel kaynakları sağlıklı, süt ve daimi dişleri kapsar. Kök hücreler, pulpadaki toplam hücre popülasyonunun sadece yaklaşık %1'ini oluşturur ve bu da etkili izolasyon ve genişletme tekniklerinin önemini vurgulamaktadır9. Sonuç olarak, bu kök hücrelerin ekstraksiyonu ve genişletilmesi, DPSC izolasyonunda çok önemli adımlardır10. Çekilmiş veya pul pul dökülmüş dişlerin, fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks tamponlu salin solüsyonu (HBSS) gibi besin açısından zengin bir taşıma ortamında saklanması gerekir.

Diş pulpasının elde edilmesi, diş tipine bağlı olarak çeşitli yöntemlerle sağlanabilir 7,11. Kökleri emilmiş süt dişleri için kök ucu üzerinden çekim yapılabilir. Benzer şekilde, olgunlaşmamış açık tepeli kalıcı dişlerden pulpa elde etmek için steril dikenli broşlar kullanılabilir. Kökleri tam gelişmiş daimi dişlerde, pulpa odasına erişim, diş kronunu kökten ayırmayı içerir. Bu, sementoenamel kavşağında bir elmas disk kullanılarak dişin kesilmesiyle gerçekleştirilir. Bu kesi, pulpa odasını açığa çıkararak pulpa dokusunun alınmasını sağlar 12,13,14.

Dental pulpa kök hücreleri (DPSC'ler), enzimatik sindirim (ED) veya spontan büyüme olarak da bilinen doku eksplantlarından (OG) büyüme yoluyla izole edilebilir. ED yöntemi, dokuyu tek hücreli süspansiyonlaraayırmak için başta kollajenaz I ve dispas olmak üzere enzimler kullanır 15,16. Daha basit ve daha hızlı olan OG yöntemi, pulpa parçalarının doğranmasını ve doğrudan bir kültür plakasına yerleştirilmesini gerektirir, bu da hücrelerin doku eksplantlarındanbüyümesine izin verir 17. Araştırmacılar, hücre proliferasyon oranlarını, izole kök hücre özelliklerinin korunmasını, farklılaşmayı ve yüzey işaretleyici ekspresyonunu değerlendirmek için her iki tekniği de kullandılar ve karşılaştırdılar18. Yüksek verimlilik ve saplılığa sahip DPSC'lerin elde edilmesi için protokollerin oluşturulması ve standartlaştırılması, etkili ve güvenli tedavilerin önünü açabilir19. Bu protokol, enzimatik sindirim, laboratuvar işleme, koruma ve adipogenez, osteogenez ve kondrogenez için kolorimetrik boyama ile hücre farklılaşması kullanılarak DPSC'lerin çıkarılmasını kapsar.

Bu makalede özetlenen protokol, diş pulpasının dişten ilk izolasyonu ile başlayan, ardından DPSC'lerin laboratuvarda kültürü ve bakımı ile devam eden ve spesifik kök hücre belirteçleri kullanılarak karakterizasyonları ile sonuçlanan adım adım bir prosedür sunmaktadır (Şekil 1). Bu kök hücreleri farklı hücre soylarına indüklemeye yönelik teknikler ve çoklu potansiyellerini vurgulama teknikleri de açıklanmaktadır.

Protokol

Burada özetlenen protokol, kurumsal insan araştırmaları etik komitesinin (IRB, Pushpagiri Araştırma Merkezi, Kerala) yönergelerine uygundur. Çekilen dişlerin kullanımı, katılımcıların bütünlüğünü, haysiyetini ve haklarını sağlamak için etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için seçilen katılımcılar, ortodontik tedavi için diş çekimi gereken 30 yaşın altındaki sağlıklı bireylerdi. Geniş diş çürüğü veya şiddetli periodontitisi olanlar çalışma dışı bırakıldı. Tutulan dişlerin çekilmesi gereken çocuklardan süt dişleri toplandı. Bu çalışmada yer alan deneklerden de bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır.

1. Dişlerin çekilmesi ve taşınması

  1. Süt ve daimi dişlerin toplanması
    1. Katılımcılara prosedürün amacını ve çekilen dişlerin araştırma amaçlı potansiyel kullanımını açıklayın.
    2. Çekilecek dişin yakınına anestezik bir madde uygulayarak lokal anestezi altında diş çekimi gerçekleştirin. Spesifik olarak, bu çalışma için 1: 200.000 oranında epinefrin ile karıştırılmış 1.75 mL lidokain (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edildi. Şiddetli diş çürüğü veya periodontitis göstermeyen dişlerin seçilmesi tercih edilir20,21.
  2. Çekilen dişlerin taşınması
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için aseptik koşullar altında çalışılması önerilir. Bu, eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipman giymeyi ve biyolojik tehlike laminer akış başlığı gibi steril bir ortamda çalışmayı içerir.
    1. Diş çekildikten sonra, kanı ve diğer kalıntıları temizlemek için steril fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonu ile durulayın. Steril forseps ve neşter kullanarak, dişin yüzeyinden yapışmış yumuşak doku kalıntılarını dikkatlice çıkarın (Şekil 2A).
    2. Dişi 10 saniye boyunca %70 etanol gibi dezenfektan bir solüsyona batırın. Dezenfeksiyondan sonra, kalan dezenfektanı yıkamak için dişi steril PBS ile durulayın.
    3. Dişi, taşıma ortamını içeren steril bir kaba yerleştirin.
      NOT: Taşıma ortamı, antibiyotiklerle desteklenmiş ticari bir kültür ortamı olan Alpha-MEM'den oluşuyordu: 100 U/mL penisilin / streptomisin (bkz. Bu besiyeri, çekilen dişin içindeki hücrelere gerekli besinleri sağladı ve laboratuvar işlemine kadar hayatta kalmalarını sağladı. Antibiyotikler bakteri üremesini engellemeye hizmet etti.
    4. Hücresel metabolik aktiviteleri yavaşlatmak ve hücre ölümünü geciktirmek için taşıma sırasında 4 ° C'lik bir sıcaklığı koruyun. Diş pulpası kök hücrelerinin işlenmesi ve izole edilmesi de dahil olmak üzere sonraki adımlar için dişi laboratuvara taşıyın.

2. Pulpa dokusunun toplanması

  1. İşlem sırasında yerinde kalmasını sağlamak için dişi diş forseps kullanarak sabitleyin. Bir su soğutucusuna bağlı bir dental el aletinde (bkz . Malzeme Tablosu) dişi kesmek için bir elmas disk kullanın (Şekil 2B).
    NOT: Amaç, içindeki pulpa dokusuna gereksiz zarar vermeden pulpa odasını açığa çıkarmaktır.
  2. Pulpa dokusunu çıkarmak için bir diş ekskavatörü kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Bu alet, pulpanın zarar vermeden ekstraksiyonunu sağlar, böylece dental pulpa kök hücrelerinin canlılığını korur (Şekil 2C).
  3. Elde edilen dokuyu bir cam Petri kabına yerleştirin. Pulpa dokusunu fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

3. Pulpa dokusunun sindirimi ve hücre izolasyonu

  1. Doku kıyma ve sindirim
    1. Steril bir cerrahi bıçakla, pulpa dokusunu dikkatlice küçük parçalara ayırın (Şekil 2D) ve ince homojenize bir karışım elde etmek için PBS'li bir mini doku öğütücüye yerleştirin. Bu işlem, sindirim sırasında daha verimli enzim etkisini kolaylaştırarak dokunun yüzey alanını arttırır.
    2. Kıyılmış homojen doku parçalarını 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 mg / mL kollajenaz tip I ve 4 mg / mL dispaz karışımı kullanarak enzimatik olarak sindirin (bkz. Bu enzimler, istenen konsantrasyonları elde etmek için Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözüldü.
    3. Pulpa dokusunu enzim karışımında (adım 3.1.2) 37 ° C'de yaklaşık 2 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, enzimleri nötralize edin ve daha fazla kültür için hücreleri santrifüjleme (adım 3.2.1) ile toplayın.
  2. Santrifüjleme ve yeniden süspansiyon
    1. İnkübasyondan sonra, sindirilmiş dokuyu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. Bu adım, hücreleri kalan sindirilmemiş doku parçalarından ve enzimlerden ayırır. Tüpün altındaki hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatan ortamı dikkatlice atın.
    2. Hücre peletini taze bir kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bu ortam, izole edilen hücrelerin hayatta kalması ve çoğalması için gerekli besinleri ve ortamı sağlar.

4. Hücre kültürü

  1. Hücrelerin kaplanması ve inkübasyonu
    1. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri dikkatlice 25 cm²'lik bir kültür şişesine aktarın.
      NOT: Tek bir hamurdan elde edilen tüm materyaller, 25cm2'lik tek bir hücre kültürü şişesine aktarılır. 5-7 mL'lik bir ortam hacmi, hücreler için yeterli kapsama alanı ve besin mevcudiyeti sağlar. DPSC'ler için kültür ortamının, gerekli büyüme faktörlerini sağlamak için% 10 -% 20 fetal sığır serumu (FBS) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) olduğundan emin olun. Ayrıca, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ortamı %1 penisilin / streptomisin ile destekleyin. Homojen büyümeyi desteklemek için hücrelerin şişe boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun.
    2. Şişeyi 37 °C'de% 5 CO2 içeren bir atmosferde inkübe edin.
  2. Orta değişim ve izleme izdihamı
    1. Taze besinler sağlamak ve metabolik atıkları gidermek için kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin. Bunu yapmak için, steril bir serolojik pipet kullanarak eski ortamı dikkatlice aspire edin ve yeni bir ortamla değiştirin.
    2. Hücrelerin büyümesini izlemek ve herhangi bir kontaminasyon belirtisi olup olmadığını kontrol etmek için hücre kültürünü mikroskop altında düzenli olarak izleyin.
    3. Hücreler %80-90 birleşim noktasına ulaşana kadar bu işleme devam edin, bu noktada hücreler şişe yüzey alanının çoğunu kaplar ancak aşırı kalabalık değildir.
  3. Hücre tripsinizasyonu ve pasajı veya donması
    1. Hücreler %80-90 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını çıkarın ve artık ortamı ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
    2. Hücreleri şişenin yüzeyinden ayırmak için şişeye %0.25'lik bir tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreler havalanana kadar 37 ° C'de 2-5 dakika inkübe edin.
    3. Eşit hacimde kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin, ardından tam hücre ayrılmasını sağlamak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
    4. Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    5. Hücreleri taze bir kültür ortamında yeniden süspanse edin ve daha fazla büyüme için yeniden plakalayın (pasaj) veya ileride kullanmak üzere dondurun. Donarken, hücreleri dondurma sırasında hasar görmekten korumak için DMSO gibi bir kriyoprotektan içeren bir dondurma ortamı kullanın.

5. DPSC'lerin karakterizasyonu

  1. Akış sitometrisi analizi
    1. İzole edilen hücrelerin mezenkimal kök hücre yapısını doğrulamak için akış sitometrisi analiziyapın 22,23. Başlangıçta, adım 4.3'te açıklandığı gibi hücreleri tripsinize edin ve toplayın.
    2. Tripan boya dışlama tekniği ile hücre canlılığını belirleyin. Analizi, 2. ve 8. geçişler sırasında bir hücre canlılık analizörü (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarakgerçekleştirin. 3. ve 7. geçişler sırasında bir akış sitometresi aracılığıyla fenotipik analiz yapın.
    3. İnkübasyondan sonra, fazla antikorları uzaklaştırmak ve hücreleri bir akış sitometresi kullanarak analiz etmek için hücreleri bir akış sitometrisi tamponunda yıkayın.
      NOT: Akış sitometrisi tamponu, fosfat tamponlu salin (1x PBS), %1-2 fetal sığır serumu (FBS) ve %0.1 sodyum azidden (NaN3) oluşur. FBS veya BSA, antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke ederken, sodyum azid bir koruyucu görevi görür. Hücrelerin yüksek bir yüzdesi mezenkimal kök hücre belirteçlerini ifade etmeli ve hematopoietik belirteçlerden yoksun olmalı, bu da kimliklerini DPSC'ler olarak doğrulamalıdır24.
    4. DPSC'leri ayırın ve akış sitometrisi analizi için immünofloresan antikorlarla boyayın.
      NOT: Mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) akış sitometrisi analizi için belirteçlerin seçimi, MSC'lerin CD105, CD73 ve CD90'ı eksprese etmesi gerektiğini ve CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79a veya CD19 ve HLA sınıf II25'in ekspresyonundan yoksun olduğunu belirten Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği (ISCT) tarafından oluşturulan fikir birliğine dayanmaktadır. Bu belirteçler, diş pulpası kök hücrelerini araştıran çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır26. Boyama için antikor konsantrasyonları, kullanılan spesifik antikora bağlı olarak değişebilir ve antikor seyreltmeleri ve inkübasyon koşulları25 için üreticinin talimatlarına (Malzeme Tablosuna bakınız) uyulması önerilir.
    5. Belirtildiği gibi CD belirteçlerinin ifadesi için sınıflandırma kriterlerini27,28 oluşturun:% 10'dan az, ifade yok; %11 ile %40 arasında, düşük ifade; %41 ila %70 aralığında, orta derecede ifade; %71'in üzerinde, yüksek ifade.
    6. Ek olarak, CD34 ve CD45'e karşı antikorlarla ayrı bir hücre alikotunu inkübe ederek hematopoietik belirteçlerin yokluğunu doğrulayın.

6. Çok soylu farklılaşma

NOT: Aşağıdaki adımlar, dental kök hücrelerin osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşması için protokolleri özetlemektedir. Tam besiyeri (CM) olan fibronektin kaplı bir doku kültürü plakasında oyuk başına 1 x 105 hücre yoğunluğunda kültürleri tohumlayarak başlayın. İstenen farklılaşma protokolünü başlatmadan önce %80-90 birleşme elde edilene kadar hücre büyümesini izleyin. DPSC'lerin çok soylu farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için, hücreleri 24 oyuklu plakalara tohumlayarak ve bunları uygun farklılaşma ortamlarında kültürleyerek osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere doğru farklılaşma sürecini başlatın.

  1. Osteojenik farklılaşma
    1. DPSC'leri standart koşullar altında düzenli bir büyüme ortamında% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar kültürleyerek başlayın.
    2. Büyüme ortamını hücrelerden çıkarın, ardından hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın. Hücrelere Osteojenik Farklılaşma Ortamını (ODM) ekleyin.
      NOT: ODM, %10 FBS, 100 birim/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 0.25 μg/mL amfoterisin B, 50 μg/mL askorbik asit, 10 mM beta-gliserofosfat ve 100 nM deksametazon ile desteklenmiş Alfa Minimum Esansiyel Ortamdan (α-MEM) oluşur (bkz.
    3. Osteojenik ortamdaki hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Osteojenik ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
      NOT: 14 ila 21 gün sonra, DPSC'ler osteoblast benzeri hücrelere farklılaşmış olmalıdır. Bu, alkalin fosfataz gibi osteoblasta özgü belirteçlerin ekspresyonunda bir artış olup olmadığını kontrol ederek veya Alizarin Red S boyaması gibi mineralize matrisi tespit etmek için boyama teknikleri kullanılarak doğrulanabilir.
    4. Hücreleri -20 °C'de 1 saat boyunca %70 buz gibi etanol ile inkübe ederek sabitleyin.
    5. Sabit hücreleri 40 nM Alizarin Red S (pH 4.2) boyama solüsyonu ile oda sıcaklığında karanlıkta 10-15 dakika boyayın. Osteojenik farklılaşmayı doğrulamak için boyamayı mikroskop altında görselleştirin (Şekil 3). Hücreleri, mineralizasyonun göstergesi olan kalsiyum birikintilerini tanımlayan Alizarin Red S ile boyayarakfarklılaşmayı doğrulayın 29,30.
  2. Adipojenik farklılaşma
    1. Daha önceki bölümde detaylandırıldığı gibi, 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde standart koşullar altında kültür DPSC'leri. Hücreleri yaklaşık% 70 -% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.
    2. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın. Yıkanmış ortamı adipojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin. Bu besiyeri genellikle DMEM, %10 FBS, 10 μg/mL insülin, 1 μM deksametazon, 200 μM indometazin ve 0.5 mM IBMX'ten oluşur (bkz.
    3. Farklılaşma ortamını her 3-4 günde bir değiştirin. Yaklaşık 3 hafta sonra, adipojenik olarak farklılaşmış DPSC'leri PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
    4. Lipid damlacık birikimini görselleştirmek için sabit hücreleri Yağ Kırmızısı O ile boyayın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 4). Adipojenik farklılaşmayı daha fazla doğrulamak için, peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör gama (PPARγ) ve adiponektin31,32 gibi adipojenik belirteçlerin gen ekspresyon analizini gerçekleştirin.
  3. Kondojenik farklılaşma
    1. 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde tutulan DPSC kültürleri, Kondrojenik farklılaşma için kullanılır. Hücreleri yaklaşık% 70 -% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.
    2. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın. Yıkanmış ortamı, tipik olarak yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 1 ITS, 100 nM deksametazon, 50 μg / mL askorbat-2-fosfat, 40 μg / mL prolin ve 10 ng / mL Dönüştürücü Büyüme Faktörü-beta 3 (TGF-β3) içeren kondrojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin (bkz.
    3. Hücreleri kondrojenik farklılaşma ortamında tutun ve ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Yaklaşık üç hafta sonra, DPSC'ler kondrosit benzeri hücrelere farklılaşmış olmalıdır.
    4. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile inkübe ederek sabitleyin. Fiksasyondan sonra, hücreleri Alcian Blue ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kondrojenik farklılaşmayı doğrulamak için mikroskop altında görselleştirin (Şekil 5).
    5. Proteoglikanlar için Alcian Blue boyama veya agrekan, SOX9 ve tip II kollajen33,34 gibi kondrojenik belirteçlerin gen ekspresyon analizi gibi teknikler kullanarak DPSC'lerin kondrositlere farklılaşmasını doğrulayın.

Sonuçlar

Ana hatlarıyla belirtilen protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, çok soylu farklılaşma yeteneğine sahip dental pulpa kök hücreleri (DPSC'ler) verdi ve bu da çok potansiyelli olduklarını gösterdi.

Canlılık testleri
DPSC'lerin yaşayabilirliği, çeşitli zaman noktalarında bir Tripan Blue dışlama testi kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, kültür dönemi boyunca sürekli olarak yüksek canlılık (%95'ten fazla) göstererek izolasyon ve kü...

Tartışmalar

Protokol, insan süt ve daimi dişlerinden diş pulpası kök hücrelerinin (DPSC'ler) izolasyonunu, kültürünü ve karakterizasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu hücrelerin depolanması ve çoğalmasının bir açıklamasının yanı sıra in vitro osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere farklılaşma potansiyellerinin değerlendirilmesini içerir35.

Chen ve ark.36, Dental Pulpa Kök Hücrelerinin (DPSC...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Thiruvalla'daki Pushpagiri Araştırma Merkezi Müdürü ve Başkanı Dr. Mathew Mazhavancheril'e, Araştırma Merkezi'ndeki prosedürlerin belgelenmesine verdiği destek için minnettardır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

Referanslar

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891 (2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175 (2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. . Regenerative medicine-from protocol to patient. , 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572 (2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945 (2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392 (2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372 (2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114 (2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854 (2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434 (2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -. G., George, J. -. M., Sweety, V. -. K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906 (2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89 (2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531 (2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Dental pulpa k k h creleriDPSC lers t di leridaimi di lerrejeneratif t pmezenkimal k k h crelerenzimatik sindirimb y meadipositlerosteoblastlarkondrositlermultipotentfarkl la mah cre izolasyonuh cre k lt rh cre koruma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır