Isolement, culture et caractérisation de cellules souches de la pulpe dentaire à partir de dents de lait et permanentes humaines

Résumé

Ce protocole met l’accent sur l’extraction, la culture et la préservation de cellules souches multipotentes de la pulpe dentaire par digestion enzymatique. De plus, il démontre leur potentiel à se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes, soulignant l’importance de la précision et de la cohérence dans le processus.

Résumé

Dans le domaine de la médecine régénérative et des applications thérapeutiques, la recherche sur les cellules souches gagne rapidement du terrain. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC), qui sont présentes dans les dents de lait et les dents permanentes, sont devenues une source vitale de cellules souches en raison de leur accessibilité, de leur adaptabilité et de leurs capacités de différenciation innées. Les DPSC offrent un réservoir abondant et facilement disponible de cellules souches mésenchymateuses, faisant preuve d’une polyvalence et d’un potentiel impressionnants, en particulier à des fins de régénération. Malgré leurs promesses, le principal obstacle réside dans l’isolement et la caractérisation efficaces des DPSC, étant donné leur représentation sous forme de fraction infime dans les cellules de la pulpe dentaire. La préservation de cette ressource cellulaire inestimable est tout aussi cruciale. Les deux méthodes prédominantes d’isolement des DPSC sont la digestion enzymatique (DE) et l’excroissance à partir d’explants de tissus (OG), souvent appelée croissance spontanée. Ce protocole se concentre principalement sur l’approche de digestion enzymatique pour l’isolement du DPSC, détaillant de manière complexe les étapes englobant l’extraction, le traitement en laboratoire et la préservation des cellules. Au-delà de l’extraction et de la préservation, le protocole se penche sur les prouesses de différenciation des DPSC. Plus précisément, il décrit les procédures employées pour induire ces cellules souches à se différencier en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes, mettant en évidence leurs attributs multipotents. L’utilisation ultérieure de techniques de coloration colorimétrique facilite la visualisation précise et la confirmation de la différenciation réussie, validant ainsi le calibre et la fonctionnalité des DPSC isolés. Ce protocole complet fonctionne comme un plan couvrant l’ensemble du spectre de l’extraction, de la culture, de la préservation et de la caractérisation des cellules souches de la pulpe dentaire. Il souligne le potentiel substantiel recèlé par les DPSC, propulsant l’exploration des cellules souches et prometteur pour de futures percées régénératives et thérapeutiques.

Introduction

La recherche sur les cellules souches a prospéré dans les sciences biomédicales en raison de ses applications prometteuses en médecine régénérative et en ingénierie tissulaire. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC), dérivées du tissu pulpaire des dents de lait et des dents permanentes humaines, ont suscité un intérêt considérable en tant que source de cellules souches en raison de leur disponibilité immédiate et de leur capacité multipotente ^1,2. Ces cellules ont le potentiel de se différencier en différents types de cellules, notamment les adipocytes, les ostéoblastes et les chondrocytes, comme le confirment de nombreuses études³.

Au cours des dernières décennies, la recherche et les applications thérapeutiques des cellules souches ont explosé. Le potentiel expansif des cellules souches exige de diversifier les sources à partir desquelles elles sont obtenues. Plusieurs facteurs influencent l’efficacité, la viabilité et la souche des cellules choisies. Malgré l’existence de divers réservoirs de cellules souches connus, tels que la moelle osseuse et les tissus adipeux, les procédures invasives, la morbidité du site et les préoccupations éthiques liées à ces sources limitent souvent leur exploration ^4,5. Parmi les différentes sources de cellules souches, les cellules souches dentaires ont attiré l’attention en raison de leur facilité d’accès, de leur grande plasticité et de leurs diverses applications potentielles. Les cellules souches de la pulpe dentaire humaine, en particulier, ont fait l’objet de recherches approfondies pour leurs perspectives thérapeutiques⁶. Les dents, souvent jetées comme déchets médicaux, contiennent une multitude de cellules souches mésenchymateuses⁷. La sauvegarde de ce précieux réservoir de cellules souches nécessite des efforts collectifs de la part des patients, des dentistes et des médecins pour s’assurer que ces ressources ne sont pas gaspillées, ce qui rend chaque cellule souche de la pulpe dentaire disponible pour les besoins futurs en matière de régénération.

Les cellules souches dérivées de la pulpe dentaire, telles que les cellules souches de la pulpe dentaire humaine adulte (DPSC) et les cellules souches de dents de lait humaines exfoliées (SHED), sont situées dans la niche périvasculaire de la pulpe dentaire. On pense que ces cellules proviennent de cellules de la crête neurale crânienne et présentent des marqueurs précoces pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les cellules souches neuroectodermiques. Les DPSC et les SHED ont démontré leur multipuissance et leur capacité à régénérer divers types de tissus⁸.

Les sources potentielles de cellules souches dentaires englobent les dents de lait et les dents permanentes saines. Les cellules souches ne représentent qu’environ 1 % de la population cellulaire totale de la pulpe, ce qui souligne l’importance de techniques efficaces d’isolement et d’expansion⁹. Par conséquent, l’extraction et l’expansion de ces cellules souches sont des étapes cruciales de l’isolement de la DPSC¹⁰. Les dents extraites ou exfoliées doivent être stockées dans un milieu de transport riche en nutriments, tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline tamponnée au hanches (HBSS).

L’obtention de la pulpe dentaire peut être obtenue par diverses méthodes, en fonction du type de dent ^7,11. Pour les dents de lait avec des racines résorbées, l’extraction peut être effectuée par l’apex de la racine. De même, les broches barbelées stériles peuvent être utilisées pour obtenir de la pulpe à partir de dents permanentes avec un apex ouvert immature. Dans le cas de dents permanentes avec des racines complètement développées, l’accès à la chambre pulpaire implique de séparer la couronne dentaire de la racine. Ceci est accompli en coupant la dent à l’aide d’un disque de diamant à la jonction du cémento-émail. Cette incision expose la chambre pulpaire, permettant de récupérer le tissu pulpaire 12,13,14.

Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) peuvent être isolées par digestion enzymatique (DE) ou excroissance d’explants de tissus (OG), également connue sous le nom de croissance spontanée. La méthode DE utilise des enzymes, principalement la collagénase I et la dispase, pour décomposer le tissu en suspensions unicellulaires^15,16. La méthode OG, plus simple et plus rapide, consiste à hacher les fragments de pulpe et à les placer directement dans une plaque de culture, permettant aux cellules de se développer à partir des explants de tissu¹⁷. Les chercheurs ont utilisé et comparé les deux techniques pour évaluer les taux de prolifération cellulaire, la préservation des propriétés des cellules souches isolées, la différenciation et l’expression des marqueurs de surface¹⁸. L’établissement et la normalisation de protocoles d’acquisition de DPSC à haute efficacité et à haute souche peuvent ouvrir la voie à des thérapies efficaces et sûres¹⁹. Ce protocole comprend l’extraction des DPSC par digestion enzymatique, le traitement en laboratoire, la préservation et la différenciation cellulaire avec coloration colorimétrique pour l’adipogenèse, l’ostéogenèse et la chondrogenèse.

Le protocole décrit dans cet article présente une procédure étape par étape, commençant par l’isolement initial de la pulpe dentaire de la dent, suivi de la culture et de l’entretien des DPSC en laboratoire, et se terminant par leur caractérisation à l’aide de marqueurs de cellules souches spécifiques (Figure 1). Les techniques permettant d’induire ces cellules souches dans différentes lignées cellulaires, mettant en évidence leur multipuissance, sont également décrites.

Protocole

Le protocole décrit dans le présent document est conforme aux directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement (IRB, Centre de recherche Pushpagiri, Kerala). L’utilisation des dents extraites a été effectuée conformément aux normes éthiques afin de garantir l’intégrité, la dignité et les droits des participants. Les participants sélectionnés pour cette étude étaient des personnes en bonne santé de moins de 30 ans qui avaient besoin d’une extraction dentaire pour un traitement orthodontique. Les personnes souffrant de caries dentaires étendues ou de parodontite sévère ont été exclues de l’étude. Des dents de lait ont été prélevées sur des enfants qui nécessitaient l’extraction des dents conservées. Un consentement écrit éclairé a également été obtenu des sujets participant à cette étude.

1. Extraction et transport des dents

1. Collecte de dents de lait et de dents permanentes
   1. Expliquez aux participants le but de la procédure et l’utilisation potentielle des dents extraites à des fins de recherche.
   2. Effectuez l’extraction des dents sous anesthésie locale en administrant un agent anesthésique à proximité de la dent à extraire. Plus précisément, 1,75 mL de lidocaïne mélangée à de l’épinéphrine (voir le tableau des matières) dans un rapport de 1:200 000 a été injecté dans le cadre de cette étude. Il est préférable de choisir des dents qui ne présentent pas de caries dentaires graves ou de parodontite^20,21.
2. Transport des dents extraites
   REMARQUE : Il est recommandé de travailler dans des conditions aseptiques pour éviter la contamination. Cela comprend le port d’un équipement de protection individuelle, comme des gants et une blouse de laboratoire, et le travail dans un environnement stérile, comme une cagoule à flux laminaire pour risque biologique.
   1. Une fois la dent extraite, rincez-la avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le sang et les autres débris. À l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel, retirez avec précaution tous les restes de tissus mous attachés à la surface de la dent (figure 2A).
   2. Immergez la dent dans une solution désinfectante, telle que de l’éthanol à 70 %, pendant 10 s. Après la désinfection, rincez la dent avec du PBS stérile pour éliminer tout désinfectant résiduel.
   3. Placez la dent dans un récipient stérile contenant le milieu de transport.
      REMARQUE : Le milieu de transport était constitué d’Alpha-MEM, un milieu de culture commercial complété par des antibiotiques : 100 U/mL de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matières). Ce milieu fournissait des nutriments essentiels aux cellules de la dent extraite, assurant leur survie jusqu’au traitement en laboratoire. Les antibiotiques servaient à inhiber la croissance bactérienne.
   4. Maintenir une température de 4 °C pendant le transport pour ralentir les activités métaboliques cellulaires et retarder la mort cellulaire. Transportez la dent au laboratoire pour les étapes suivantes, y compris le traitement et l’isolement des cellules souches de la pulpe dentaire.

2. Prélèvement de tissu pulpaire

1. Fixez la dent à l’aide d’une pince dentaire pour vous assurer qu’elle reste en place pendant la procédure. À l’aide d’un disque diamanté, coupez la dent d’une pièce à main dentaire (voir le tableau des matériaux) reliée à un liquide de refroidissement à eau (Figure 2B).
   REMARQUE : L’objectif est d’exposer la chambre pulpaire sans causer de dommages inutiles au tissu pulpaire à l’intérieur.
2. Utilisez une excavatrice dentaire (voir le tableau des matériaux) pour retirer le tissu pulpaire. Cet instrument permet d’extraire la pulpe sans infliger de dommages, préservant ainsi la viabilité des cellules souches de la pulpe dentaire (Figure 2C).
3. Placez le tissu obtenu sur une boîte de Pétri en verre. Lavez le tissu pulpaire avec une solution saline tamponnée au phosphate.

3. Digestion du tissu pulpaire et isolement cellulaire

1. Hachage et digestion des tissus
   1. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile, hachez soigneusement le tissu pulpaire en petits fragments (Figure 2D) et placez-le dans un mini broyeur de tissus avec du PBS pour obtenir un mélange finement homogénéisé. Ce processus augmente la surface des tissus, facilitant une action enzymatique plus efficace pendant la digestion.
   2. Transférez les fragments de tissu homogène haché dans un tube de 15 mL et digérez par voie enzymatique à l’aide d’un mélange de 3 mg/mL de collagénase de type I et de 4 mg/mL de dispase (voir le tableau des matières). Ces enzymes ont été dissoutes dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour atteindre les concentrations souhaitées.
   3. Incuber le tissu pulpaire dans le mélange enzymatique (étape 3.1.2) pendant environ 2 h à 37 °C. Après l’incubation, neutralisez les enzymes et collectez les cellules par centrifugation (étape 3.2.1) pour une culture ultérieure.
2. Centrifugation et remise en suspension
   1. Après l’incubation, transférez le tissu digéré dans un tube à centrifuger de 15 ml et faites-le tourner à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante pour granuler les cellules. Cette étape sépare les cellules des fragments de tissus non digérés et des enzymes restants. Jetez soigneusement le milieu surnageant, en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire au fond du tube.
   2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture frais. Ce milieu fournit les nutriments et l’environnement nécessaires à la survie et à la prolifération des cellules isolées.

4. Culture cellulaire

1. Placage et incubation des cellules
   1. Transférez délicatement les cellules remises en suspension dans une fiole de culture de 25 cm².
      REMARQUE : Tout le matériel d’une seule pulpe est transféré dans un seul ballon de culture cellulaire de^{25 cm 2} . Un volume de média de 5 à 7 ml assure une couverture suffisante et une disponibilité des nutriments pour les cellules. S’assurer que le milieu de culture des DPSC est le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 à 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) (voir le tableau des matériaux) pour fournir les facteurs de croissance nécessaires. De plus, complétez le milieu avec 1% de pénicilline/streptomycine pour éviter la contamination bactérienne. Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans le flacon pour favoriser une croissance homogène.
   2. Incuber le ballon à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO₂.
2. Changement de milieu et surveillance de la confluence
   1. Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours pour apporter des nutriments frais et éliminer les déchets métaboliques. Pour ce faire, aspirez soigneusement l’ancien milieu à l’aide d’une pipette sérologique stérile et remplacez-le par un milieu frais.
   2. Surveillez régulièrement la culture cellulaire au microscope pour suivre la croissance des cellules et vérifier tout signe de contamination.
   3. Continuez ce processus jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % à 90 % de confluence, point auquel les cellules couvrent la majeure partie de la surface du ballon mais ne sont pas trop encombrées.
3. Trypsinisation cellulaire et passage ou congélation
   1. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le milieu résiduel et les cellules non adhérentes.
   2. Ajouter une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans le ballon pour détacher les cellules de la surface du ballon. Incuber pendant 2 à 5 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se décollent.
   3. Neutralisez la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu de culture, puis pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour assurer un détachement complet des cellules.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules.
   5. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de culture frais et replaquez-les (passage) pour une croissance ultérieure ou congelez-les pour une utilisation future. Lors de la congélation, utilisez un milieu de congélation qui contient un cryoprotecteur, comme le DMSO, pour protéger les cellules des dommages pendant la congélation.

5. Caractérisation des DPSC

1. Analyse par cytométrie en flux
   1. Pour confirmer la nature des cellules souches mésenchymateuses des cellules isolées, effectuez une analyse par cytométrie en flux^22,23. Dans un premier temps, essayez de réduire et de prélever des cellules comme décrit à l’étape 4.3.
   2. Déterminer la viabilité cellulaire par la technique d’exclusion du colorant trypan. Effectuez l’analyse à l’aide d’un analyseur de viabilité cellulaire (voir Tableau des matériaux) lors des 2^ème et 8ème^passages . Réaliser une analyse phénotypique via un cytomètre de flux lors des 3ème^et 7ème^passages .
   3. Après l’incubation, lavez les cellules dans un tampon de cytométrie en flux pour éliminer l’excès d’anticorps et analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
      REMARQUE : Le tampon de cytométrie en flux est composé d’une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS), de 1 % à 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de 0,1 % d’azoture de sodium (NaN₃). Le FBS ou BSA bloque la liaison non spécifique des anticorps, tandis que l’azoture de sodium agit comme un conservateur. Un pourcentage élevé de cellules doit exprimer les marqueurs des cellules souches mésenchymateuses et manquer des marqueurs hématopoïétiques, confirmant leur identité en tant que DPSC²⁴.
   4. Détachez les DPSC et colorez-les avec des anticorps d’immunofluorescence pour l’analyse par cytométrie en flux.
      REMARQUE : La sélection des marqueurs pour l’analyse par cytométrie en flux des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est basée sur le consensus établi par la Société internationale de thérapie cellulaire (ISCT), qui stipule que les CSM doivent exprimer CD105, CD73 et CD90, et ne pas exprimer CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19, et HLA classe II²⁵. Ces marqueurs sont couramment utilisés dans les études portant sur les cellules souches de la pulpe dentaire²⁶. Les concentrations d’anticorps pour la coloration peuvent varier en fonction de l’anticorps spécifique utilisé, et il est recommandé de suivre les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) pour les dilutions d’anticorps et les conditions d’incubation²⁵.
   5. Etablir les critères de classification^27,28 pour l’expression des marqueurs CD tels que mentionnés : moins de 10%, aucune expression ; entre 11 % et 40 %, faible expression ; une plage de 41 % à 70 %, expression modérée ; au-dessus de 71%, expression élevée.
   6. De plus, confirmer l’absence de marqueurs hématopoïétiques en incubant une aliquote cellulaire distincte avec des anticorps contre CD34 et CD45.

6. Différenciation multilignée

REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent les protocoles de différenciation ostéogénique, adipogénique et chondrogénique des cellules souches dentaires. Commencez par ensemencer des cultures à une densité de 1 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire enrobée de fibronectine avec un milieu complet (CM). Surveillez la croissance cellulaire jusqu’à ce que 80 % à 90 % de confluence soit atteinte avant de lancer le protocole de différenciation souhaité. Pour évaluer le potentiel de différenciation multilignée des DPSC, amorcez le processus de différenciation vers les ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes en ensemencant les cellules dans des plaques à 24 puits et en les cultivant dans des milieux de différenciation appropriés.

1. Différenciation ostéogénique
   1. Commencer par cultiver les DPSC dans un milieu de croissance régulier dans des conditions standard jusqu’à ce qu’ils atteignent 70 % à 80 % de confluence.
   2. Retirez le milieu de croissance des cellules, puis lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Ajoutez le milieu de différenciation ostéogénique (ODM) aux cellules.
      REMARQUE : L’ODM se compose d’un milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) complété par 10 % de FBS, 100 unités/ml de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 50 μg/mL d’acide ascorbique, 10 mM de bêta-glycérophosphate et 100 nM de dexaméthasone (voir le tableau des matériaux).
   3. Incuber les cellules dans le milieu ostéogénique à 37 °C avec 5% de CO₂. Changez le milieu ostéogénique tous les 2-3 jours.
      REMARQUE : Après 14 à 21 jours, les DPSC devraient s’être différenciés en cellules de type ostéoblaste. Cela peut être confirmé en vérifiant une augmentation de l’expression de marqueurs spécifiques aux ostéoblastes, tels que la phosphatase alcaline, ou en utilisant des techniques de coloration pour détecter la matrice minéralisée, telles que la coloration au rouge d’alizarine S.
   4. Fixez les cellules en les incubant avec de l’éthanol glacé à 70 % pendant 1 h à -20 °C.
   5. Colorer les cellules fixées avec une solution de coloration au rouge d’alizarine S (pH 4,2) à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 à 15 min. Visualiser la coloration au microscope pour confirmer la différenciation ostéogénique (Figure 3). Confirmer la différenciation en colorant les cellules avec du rouge d’alizarine S, ce qui identifie les dépôts de calcium indiquant une minéralisation^29,30.
2. Différenciation adipogénique
   1. Comme détaillé dans la section précédente, cultiver des DPSC dans des conditions standard dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂ à 37 °C. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent environ 70 % à 80 % de confluence.
   2. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Remplacer le milieu délavé par un milieu de différenciation adipogénique. Ce milieu se compose généralement de DMEM, de 10 % de FBS, de 10 μg/mL d’insuline, de 1 μM de dexaméthasone, de 200 μM d’indométacine et de 0,5 mM d’IBMX (voir le tableau des matériaux).
   3. Changez le milieu de différenciation tous les 3-4 jours. Après environ 3 semaines, lavez les DPSC adipogènes différenciés avec du PBS et fixez-les avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 20 min à température ambiante.
   4. Teindre les cellules fixées avec du O rouge huile (voir le tableau des matériaux) pour visualiser l’accumulation de gouttelettes lipidiques (Figure 4). Pour confirmer davantage la différenciation adipogénique, effectuez une analyse de l’expression génique des marqueurs adipogéniques tels que le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) et l’adiponectine^31,32.
3. Différenciation chondrogénique
   1. Des cultures de DPSC maintenues dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂ à 37 °C sont utilisées pour la différenciation chondrogénique. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent environ 70 % à 80 % de confluence.
   2. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Remplacez le milieu lessivé par un milieu de différenciation chondrogénique, qui contient généralement du milieu modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose, 1 % d’ITS, 100 nM de dexaméthasone, 50 μg/mL d’ascorbate-2-phosphate, 40 μg/mL de proline et 10 ng/mL de facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGF-β3) (voir le tableau des matériaux).
   3. Maintenez les cellules dans le milieu de différenciation chondrogénique, en changeant le milieu tous les 2-3 jours. Après environ trois semaines, les DPSC devraient s’être différenciés en cellules de type chondrocytes.
   4. Fixez les cellules en les incubant avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Après fixation, colorer les cellules avec du bleu d’Alcian (voir Tableau des matériaux) et les visualiser au microscope pour confirmer la différenciation chondrogénique (Figure 5).
   5. Confirmez la différenciation des DPSC en chondrocytes à l’aide de techniques telles que la coloration au bleu d’Alcian pour les protéoglycanes ou l’analyse de l’expression génique de marqueurs chondrogéniques tels que l’agrégatécane, le SOX9 et le collagène de type II^33,34.

Résultats

L’exécution réussie du protocole décrit a permis d’obtenir des cellules souches de pulpe dentaire (DPSC) capables de différenciation multilignée, démontrant ainsi leur multipotence.

Tests de viabilité
La viabilité des DPSC a été évaluée à l’aide d’un test d’exclusion au bleu de trypan à divers moments. Les résultats montrent une viabilité élevée et constante (supérieure à 95 %) tout au long de la période de culture, ce qui démontre la robuste...

Discussion

Le protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) à partir de dents humaines à feuilles caduques et permanentes. Il comprend une description du stockage et de la prolifération de ces cellules, ainsi que l’évaluation de leur potentiel de différenciation in vitro en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes³⁵.

Chen et ^al.36 ont démontré qu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-isobuty-l-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	I5879
Acetic acid	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	AS001
Alcian Blue	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	RM471
Alizarin Red S staining solution	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	GRM894
Alkaline phosphatase -Staining kit	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Antibiotic/Antimycotic	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	P4333
Ascorbate-2-phosphate	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	012-04802
Beta-glycerophosphate	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	G9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hood	Labconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DR	BioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP025	Cell strainer
Centrifuge	REMI Elektrotechnik Limited (REMI)
Centrifuge	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	1101 | 1102
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth Medium	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	AT006	DMEM
Conical tubes (15 or 50 )	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	546021P/546041P	15 mL and 50 mL
Cryo freezing container	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	15-350-50
Cryolabels	Label India:
Cryovial storage boxes	Cryostore Storage Boxes
Cryovials	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	PW1282	Self standing
Culture flask (25 cm²)	Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasks	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCG4/TCG6	T25/T75
Culture Plates	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP129/TCP008	60 mm/100 mm
Dental Diamond Discs	Komet SC 29730, USA		Komet
Dental Spoon Excavator	Brasseler,GA 31419,USA	5023591U0
Dexamethasone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dexamethosone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dexamethosone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TC185
Dispase	Roche Diagnostics,Mannheim,Germany.
Dispase	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	MB106
Ethanol -70%	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Fisher Scientific
Extraction forceps	Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	RM9954
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plate	Corning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometer	BD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry buffer	BD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mm	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece	NSK Ltd,Tokyo 8216, Japan		Ti-Max Z series
Horse Serum	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Indomethacin	Pfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premix	Corning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscope	Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	I9516
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	MB063
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrine	DENTSPLY,NC 28277,USA		Citanest
Liquid Nitrogen	Air Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tank	Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
Micropipettes	Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany	30020	Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinder	Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USA		ReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezer	Blue Star Limited
Neubauer counting chamber	Marienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stain	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM)	STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL119
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific		Gibco
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific,MA, USA		Gibco
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	P3813-1PAK	1x PBS, pH 7.4
Proline	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15	Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UK	BDF-6955C
Sodium Hypochlorite	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	AS102	4% w/v solution
Sterile centrifuge tubes	Tarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL	3M Center, MN 55144-1000,USA		3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich, USA	P3813-1PAK	1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )	Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tips	Eppendorf India Limited
Surgical Blade Handle	Becton, Dickinson and Co.,NJ,USA	371030	BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)	R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)	R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL046
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL046
Trypsin-EDTA	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bath	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	BSW-01D