来自人类乳牙和恒牙的牙髓干细胞的分离、培养和表征

摘要

该方案强调通过酶消化从牙髓中提取、培养和保存多能干细胞。此外，它展示了它们分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜力，突出了过程中精度和一致性的重要性。

摘要

在再生医学和治疗应用领域，干细胞研究正在迅速获得关注。牙髓干细胞 （DPSC） 存在于乳牙和恒牙中，由于其可及性、适应性和先天分化能力，已成为重要的干细胞来源。DPSC 提供了现成且丰富的间充质干细胞库，展示了令人印象深刻的多功能性和潜力，特别是用于再生目的。尽管它们很有希望，但主要障碍在于有效地分离和表征 DPSC，因为它们在牙髓细胞中表示为微小部分。同样重要的是妥善保存这种宝贵的细胞资源。DPSC 分离的两种主要方法是酶消化 （ED） 和组织外植体生长 （OG），通常称为自发生长。该方案主要集中在 DPSC 分离的酶消化方法上，错综复杂地详细说明了包括提取、实验室处理和细胞保存在内的步骤。除了提取和保存之外，该方案还深入研究了 DPSC 的分化能力。具体来说，它概述了用于诱导这些干细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的程序，展示了它们的多能属性。随后使用比色染色技术有助于准确可视化和确认成功分化，从而验证分离的 DPSC 的口径和功能。这个全面的方案就像一个蓝图，涵盖了牙髓干细胞提取、培养、保存和表征的整个范围。它强调了 DPSC 所蕴藏的巨大潜力，推动了干细胞的探索，并为未来的再生和治疗突破带来了希望。

引言

由于干细胞研究在再生医学和组织工程方面的应用前景广阔，因此在生物医学科学中蓬勃发展。牙髓干细胞 （DPSC） 来源于人类乳牙和恒牙的牙髓组织，由于其现成的可用性和多能能力，作为干细胞的来源引起了人们的极大兴趣 ^1,2。正如大量研究所证实的那样，这些细胞有可能分化成各种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞³。

在过去的几十年里，干细胞的研究和治疗应用激增。干细胞的巨大潜力要求获得干细胞的来源多样化。有几个因素会影响所选细胞的效率、活力和干性。尽管存在各种已知的干细胞储存库，例如骨髓和脂肪组织，但与这些来源相关的侵入性手术、部位发病率和伦理问题通常会限制他们的探索 ^4,5。在各种干细胞来源中，牙科干细胞因其易于获取、高可塑性和多种潜在应用而受到关注。尤其是人类牙髓干细胞，其治疗前景已被广泛研究⁶。牙齿通常作为医疗废物丢弃，但含有丰富的间充质干细胞⁷。保护这个宝贵的干细胞库需要患者、牙医和医生的共同努力，以确保这些资源不被浪费，使每个牙髓干细胞都能满足未来的再生需求。

牙髓来源的干细胞，例如人类成人牙髓干细胞 （DPSC） 和来自剥落的人乳牙 （SHED） 的干细胞，位于牙髓的血管周围生态位中。这些细胞被认为起源于颅神经嵴细胞，并表现出间充质干细胞 （MSC） 和神经外胚层干细胞的早期标志物。DPSC 和 SHED 已证明具有多能性和再生多种组织类型的能力⁸。

牙科干细胞的潜在来源包括健康的乳牙和恒牙。干细胞仅占牙髓中细胞总数的 1% 左右，这凸显了有效分离和扩增技术的重要性⁹。因此，这些干细胞的提取和扩增是 DPSC 分离的关键步骤¹⁰。拔出或脱落的牙齿需要储存在营养丰富的运输介质中，例如磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或 Hanks 缓冲盐水溶液 （HBSS）。

可以通过多种方法获得牙髓，具体取决于牙齿类型 ^7,11。对于根部吸收的乳牙，可以通过根尖进行拔牙。同样，无菌倒钩拉刀可用于从根尖未成熟开放的恒牙中获取牙髓。在牙根完全发育的恒牙的情况下，进入牙髓室包括将牙冠与牙根分离。这是通过在牙骨质牙釉质交界处使用金刚石盘切割牙齿来实现的。这个切口暴露了牙髓室，从而能够取出牙髓组织 12,13,14。

牙髓干细胞 （DPSC） 可以通过酶消化 （ED） 或组织外植体 （OG） 的生长（也称为自发生长）来分离。ED 方法使用酶（主要是胶原酶 I 和分散酶）将组织分解成单细胞悬液^15,16。OG 方法更简单、更快捷，需要将果肉片段切碎并直接放入培养板中，让细胞从组织外植体中生长¹⁷。研究人员利用并比较了这两种技术来评估细胞增殖速率、分离干细胞特性的保留、分化和表面标志物表达¹⁸。建立和标准化高效和干性获取 DPSCs 的方案可以为有效和安全的疗法铺平道路¹⁹。该方案包括使用酶消化、实验室处理、保存和细胞分化提取 DPSC，并通过比色染色进行脂肪生成、成骨和软骨生成。

本文中概述的方案提出了一个循序渐进的程序，从从牙齿中初步分离牙髓开始，然后在实验室中培养和维护 DPSC，最后使用特定的干细胞标志物对其进行表征（图 1）。还描述了将这些干细胞诱导成不同细胞谱系的技术，突出了它们的多能性。

研究方案

此处概述的协议符合机构人类研究伦理委员会（IRB，Pushpagiri 研究中心，喀拉拉邦）的指导方针。拔牙的使用遵循道德标准进行，以确保参与者的完整性、尊严和权利。本研究选择的参与者是 30 岁以下需要拔牙进行正畸治疗的健康个体。那些患有广泛龋齿或严重牙周炎的人被排除在研究之外。从需要拔除保留牙的儿童中收集乳牙。还获得了参与本研究的受试者的知情书面同意书。

1. 牙齿的拔除和运输

1. 乳牙和恒牙的收集
   1. 向参与者解释手术的目的以及拔出的牙齿可能用于研究目的。
   2. 在局部麻醉下通过在要拔牙的牙齿附近施用麻醉剂进行拔牙。具体来说，在本研究中，以 1:200,000 的比例注射 1.75 mL 利多卡因与肾上腺素（参见材料表）的混合物。最好选择没有表现出严重龋齿或牙周炎的牙齿^20,21.
2. 拔牙的运输
   注意:建议在无菌条件下工作以避免污染。这包括佩戴个人防护设备，例如手套和实验服，以及在无菌环境中工作，例如生物危害层流罩。
   1. 拔牙后，用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液冲洗，以去除血液和其他碎屑。使用无菌镊子和手术刀，小心地从牙齿表面去除任何附着的软组织残留物（图 2A）。
   2. 将牙齿浸入消毒剂溶液（如 70% 乙醇）中 10 秒。消毒后，用无菌 PBS 冲洗牙齿，以洗去任何残留的消毒剂。
   3. 将牙齿放入含有运输介质的无菌容器中。
      注:运输培养基由 Alpha-MEM 组成，这是一种补充有抗生素的商业培养基:100 U/mL 青霉素/链霉素（参见 材料表）。这种培养基为拔出的牙齿内的细胞提供必需的营养物质，确保它们在实验室处理前存活。抗生素用于抑制细菌生长。
   4. 在运输过程中保持 4 °C 的温度以减缓细胞代谢活动并延迟细胞死亡。将牙齿运送到实验室进行下一步，包括处理和分离牙髓干细胞。

2. 牙髓组织的收集

1. 使用牙科镊子固定牙齿，以确保它在手术过程中保持在原位。使用金刚石盘在连接到水冷却剂的牙科手机（参见 材料表）中切割牙齿（图 2B）。
   注意:目标是暴露牙髓室，而不会对内部的牙髓组织造成不必要的伤害。
2. 使用牙科挖掘机（见 材料表）去除牙髓组织。该仪器可以在不造成损坏的情况下提取牙髓，从而保持牙髓干细胞的活力（图 2C）。
3. 将获得的组织放在玻璃培养皿上。用磷酸盐缓冲盐水清洗牙髓组织。

3. 牙髓组织的消化和细胞分离

1. 组织切碎和消化
   1. 用无菌手术刀片小心地将牙髓组织切碎成小碎片（图 2D），并将其放入含有 PBS 的微型组织研磨机中，以获得精细均质的混合物。这个过程增加了组织的表面积，促进了消化过程中更有效的酶作用。
   2. 将切碎的均质组织片段转移到 15 mL 试管中，并使用 3 mg/mL I 型胶原酶和 4 mg/mL 分散酶的混合物进行酶消化（参见 材料表）。将这些酶溶解在 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中以达到所需浓度。
   3. 将牙髓组织在酶混合物中孵育（步骤3.1.2）在37°C下孵育约2小时。 孵育后，中和酶，并通过离心（步骤 3.2.1）收集细胞以进行进一步培养。
2. 离心和重悬
   1. 孵育后，将消化的组织转移到 15 mL 离心管中，并在室温下以 300 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。此步骤将细胞与剩余的未消化的组织片段和酶分离。小心丢弃上清液培养基，确保不会干扰试管底部的细胞沉淀。
   2. 将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。该培养基为分离的细胞生存和增殖提供了必要的营养和环境。

4. 细胞培养

1. 细胞的铺板和孵育
   1. 小心地将重悬的细胞转移到 25 cm² 培养瓶中。
      注:将来自单个牙髓的所有材料转移到单个 25 cm² 细胞培养瓶中。5-7 mL 的培养基体积可确保细胞有足够的覆盖率和营养可用性。确保 DPSC 的培养基是 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），补充有 10%-20% 胎牛血清 （FBS）（见 材料表），以提供必要的生长因子。此外，在培养基中补充 1% 青霉素/链霉素，以防止细菌污染。确保细胞均匀分布在整个培养瓶中，以促进均匀生长。
   2. 将培养瓶在 37 °C 下在含有 5% CO₂ 的环境中孵育。
2. 介质更换和监测汇合度
   1. 每 2-3 天更换一次培养基，以提供新鲜的营养物质并去除代谢废物。为此，请使用无菌血清移液管小心吸出旧培养基，并用新鲜培养基替换。
   2. 定期在显微镜下监测细胞培养物，以跟踪细胞的生长并检查是否有任何污染迹象。
   3. 继续此过程，直到细胞达到 80%-90% 汇合，此时细胞覆盖大部分培养瓶表面积，但不会过于拥挤。
3. 细胞胰蛋白酶消化和传代或冷冻
   1. 一旦细胞达到 80%-90% 汇合度，去除培养基并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞，以去除残留培养基和非贴壁细胞。
   2. 向培养瓶中加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，以将细胞从培养瓶表面分离。在 37 °C 下孵育 2-5 分钟，直到细胞脱落。
   3. 通过添加等体积的培养基来中和胰蛋白酶，然后轻轻上下移液细胞悬液以确保细胞完全分离。
   4. 在室温下以 300 x g 离心细胞悬液 5 分钟以沉淀细胞。
   5. 将细胞重悬于新鲜培养基中，然后重新铺板（传代）以进一步生长或冷冻以备将来使用。冻存时，使用含有冷冻保护剂（如 DMSO）的冻存培养基，以保护细胞在冻存过程中免受损伤。

5. DPSCs 的表征

1. 流式细胞术分析
   1. 为了确认分离细胞的间充质干细胞性质，进行流式细胞术分析^22,23。最初，按照步骤 4.3 中的说明胰蛋白酶消化并收集细胞。
   2. 通过台盼染料排除技术确定细胞活力。在^{第 2 次}和^{第 8 次}传代期间使用细胞活力分析仪（参见材料表）进行分析。在^{第 3 次}和第 7^次传代期间通过流式细胞仪进行表型分析。
   3. 孵育后，在流式细胞术缓冲液中洗涤细胞以去除多余的抗体，并使用流式细胞仪分析细胞。
      注:流式细胞术缓冲液由磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS）、1%-2% 胎牛血清 （FBS） 和 0.1% 叠氮化钠 （NaN₃） 组成。FBS 或 BSA 阻断抗体的非特异性结合，而叠氮化钠起到防腐剂的作用。高比例的细胞应表达间充质干细胞标志物，而缺乏造血标志物，从而证实它们作为 DPSCs 的身份²⁴。
   4. 分离 DPSC 并用免疫荧光抗体染色以进行流式细胞术分析。
      注:用于间充质干细胞 （MSC） 流式细胞术分析的标志物的选择基于国际细胞治疗学会 （ISCT） 建立的共识，该共识指出 MSC 应表达 CD105、CD73 和 CD90，并且缺乏 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a 或 CD19 的表达，以及 HLA II 类²⁵。这些标记物通常用于调查牙髓干细胞的研究²⁶。用于染色的抗体浓度可能因所使用的特定抗体而异，建议按照制造商的说明（参见 材料表）了解抗体稀释度和孵育条件²⁵。
   5. 为上述 CD 标志物的表达建立分类标准^27,28:小于 10%，无表达;在 11% 到 40% 之间，低表达;范围为 41%-70%，中等表达;高于 71%，高表达。
   6. 此外，通过将单独的细胞等分试样与抗 CD34 和 CD45 的抗体一起孵育来确认不存在造血标志物。

6. 多谱系分化

注意:以下步骤概述了牙科干细胞成骨、成脂和成软骨分化的方案。首先，将培养物以每孔 1 x 10⁵ 个细胞的密度接种在含有完全培养基 （CM） 的纤连蛋白包被的组织培养板中。在开始所需的分化方案之前，监测细胞生长直至达到 80%-90% 汇合。为了评估 DPSC 的多系分化潜力，通过将细胞接种到 24 孔板中并在适当的分化培养基中培养它们，启动向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化过程。

1. 成骨分化
   1. 通过在标准条件下在常规生长培养基中培养 DPSC 来启动，直到它们达到 70%-80% 汇合。
   2. 从细胞中取出生长培养基，然后用 1x PBS 洗涤细胞一次。将成骨分化培养基 （ODM） 添加到细胞中。
      注:ODM 由补充有 10% FBS、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.25 μg/mL 两性霉素 B、50 μg/mL 抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸酯和 100 nM 地塞米松的 Alpha 最低必需培养基 （α-MEM） 组成（参见 材料表）。
   3. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 的成骨培养基中孵育。每 2-3 天更换一次成骨培养基。
      注意:14 到 21 天后，DPSC 应该已经分化成成骨细胞样细胞。这可以通过检查成骨细胞特异性标志物（如碱性磷酸酶）的表达增加，或使用染色技术检测矿化基质（如茜素红 S 染色）来确认。
   4. 通过在-20°C下用70%冰冷的乙醇孵育1小时来固定细胞。
   5. 在室温下，在黑暗中用 40 nM 茜素红 S （pH 4.2） 染色溶液对固定的细胞进行染色 10-15 分钟。在显微镜下观察染色以确认成骨分化（图 3）。通过用茜素红 S 对细胞进行染色来确认分化，茜素红 S 可识别指示矿化的钙沉积^{物 29,30}。
2. 成脂分化
   1. 如上一节所述，在标准条件下，在 37 °C 下 CO2 含量为 5% 的潮湿环境中培养 DPSC。 当细胞达到约 70%-80% 汇合时传代细胞。
   2. 吸出培养基并用 1x PBS 洗涤细胞一次。用成脂分化培养基替换洗脱的培养基。该培养基通常由 DMEM、10% FBS、10 μg/mL 胰岛素、1 μM 地塞米松、200 μM 吲哚美辛和 0.5 mM IBMX 组成（参见 材料表）。
   3. 每 3-4 天更换一次分化培养基。约 3 周后，用 PBS 洗涤产脂分化的 DPSC，并在室温下用 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定 20 分钟。
   4. 用油红 O 对固定的细胞进行染色（参见材料表），以观察脂滴积累（图 4）。为了进一步确认成脂分化，对过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （PPARγ） 和脂联素^31,32 等成脂标志物进行基因表达分析。
3. 软骨形成分化
   1. 在 37 °C 下维持在 5% CO₂ 的潮湿气氛中的 DPSC 培养物用于软骨形成分化。当细胞达到约 70%-80% 汇合时传代细胞。
   2. 吸出培养基并用 1x PBS 洗涤细胞一次。用软骨形成分化培养基替换洗脱的培养基，该培养基通常含有高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）、1% ITS、100 nM 地塞米松、50 μg/mL 抗坏血酸-2-磷酸盐、40 μg/mL 脯氨酸和 10 ng/mL 转化生长因子-β 3 （TGF-β3）（参见 材料表）。
   3. 将细胞维持在软骨形成分化培养基中，每 2-3 天更换一次培养基。大约三周后，DPSC 应该已经分化成软骨细胞样细胞。
   4. 通过在室温下将细胞与 4% 多聚甲醛 （PFA） 孵育 20 分钟来固定细胞。固定后，用阿尔新蓝对细胞进行染色（参见 材料表）并在显微镜下观察它们以确认软骨形成分化（图 5）。
   5. 使用用于蛋白聚糖的阿尔新蓝染色或聚集蛋白聚糖、SOX9 和 II 型胶原蛋白等软骨形成标志物的基因表达分析等技术确认 DPSC 分化为软骨细胞^33,34。

结果

概述方案的成功执行产生了能够进行多系分化的牙髓干细胞 （DPSC），证明了它们的多能性。

活力检测
在不同时间点使用台盼蓝排除测定法评估 DPSCs 的活力。结果显示，在整个培养过程中始终保持高活力（大于 95%），证明了我们的分离和培养方案的稳健性。

菌落形成单位 （CFU） 检测
进行 CFU 测定以评估 DPSC 的自我更新能?...

讨论

该方案概述了从人类乳牙和恒牙中分离、培养和表征牙髓干细胞 （DPSC）。它包括对这些细胞的储存和增殖的描述， 以及它们体外 分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜力的评估³⁵。

Chen 等人³⁶ 证明牙髓干细胞 （DPSC） 可以从各种来源获得，包括受牙周炎、牙根吸收、冠周炎和牙齿断裂等疾病影响的受感染的重...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-isobuty-l-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	I5879
Acetic acid	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	AS001
Alcian Blue	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	RM471
Alizarin Red S staining solution	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	GRM894
Alkaline phosphatase -Staining kit	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Gibco
Antibiotic/Antimycotic	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	P4333
Ascorbate-2-phosphate	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	012-04802
Beta-glycerophosphate	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	G9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hood	Labconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DR	BioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP025	Cell strainer
Centrifuge	REMI Elektrotechnik Limited (REMI)
Centrifuge	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	1101 | 1102
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth Medium	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	AT006	DMEM
Conical tubes (15 or 50 )	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	546021P/546041P	15 mL and 50 mL
Cryo freezing container	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	15-350-50
Cryolabels	Label India:
Cryovial storage boxes	Cryostore Storage Boxes
Cryovials	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	PW1282	Self standing
Culture flask (25 cm²)	Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasks	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCG4/TCG6	T25/T75
Culture Plates	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP129/TCP008	60 mm/100 mm
Dental Diamond Discs	Komet SC 29730, USA		Komet
Dental Spoon Excavator	Brasseler,GA 31419,USA	5023591U0
Dexamethasone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dexamethosone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dexamethosone	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	D4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TC185
Dispase	Roche Diagnostics,Mannheim,Germany.
Dispase	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	MB106
Ethanol -70%	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA		Fisher Scientific
Extraction forceps	Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	RM9954
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA	F2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plate	Corning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometer	BD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry buffer	BD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mm	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece	NSK Ltd,Tokyo 8216, Japan		Ti-Max Z series
Horse Serum	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Indomethacin	Pfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	I5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premix	Corning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscope	Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	I9516
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	MB063
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrine	DENTSPLY,NC 28277,USA		Citanest
Liquid Nitrogen	Air Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tank	Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
Micropipettes	Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany	30020	Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinder	Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USA		ReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezer	Blue Star Limited
Neubauer counting chamber	Marienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stain	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM)	STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL119
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	TS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific		Gibco
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific,MA, USA		Gibco
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	P3813-1PAK	1x PBS, pH 7.4
Proline	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15	Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UK	BDF-6955C
Sodium Hypochlorite	HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India	AS102	4% w/v solution
Sterile centrifuge tubes	Tarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL	3M Center, MN 55144-1000,USA		3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich, USA	P3813-1PAK	1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )	Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tips	Eppendorf India Limited
Surgical Blade Handle	Becton, Dickinson and Co.,NJ,USA	371030	BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)	R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)	R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL046
Trypan Blue 0.4%	Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA	TCL046
Trypsin-EDTA	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bath	Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA	BSW-01D