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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Zusammenfassung

Im Bereich der regenerativen Medizin und therapeutischer Anwendungen gewinnt die Stammzellforschung rasant an Bedeutung. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die sowohl in Milchzähnen als auch in bleibenden Zähnen vorkommen, haben sich aufgrund ihrer Zugänglichkeit, Anpassungsfähigkeit und angeborenen Differenzierungsfähigkeit zu einer wichtigen Stammzellquelle entwickelt. DPSCs bieten ein leicht verfügbares und reichlich vorhandenes Reservoir an mesenchymalen Stammzellen und zeigen eine beeindruckende Vielseitigkeit und ein beeindruckendes Potenzial, insbesondere für regenerative Zwecke. Trotz ihres Versprechens liegt die größte Hürde in der effektiven Isolierung und Charakterisierung von DPSCs, da sie nur als winzige Fraktion in Zahnpulpazellen dargestellt werden. Ebenso wichtig ist die richtige Konservierung dieser unschätzbaren zellulären Ressource. Die beiden vorherrschenden Methoden für die DPSC-Isolierung sind die enzymatische Verdauung (ED) und das Auswachsen aus Gewebeexplantaten (OG), die oft als Spontanwachstum bezeichnet werden. Dieses Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf den enzymatischen Verdauansatz für die DPSC-Isolierung und beschreibt detailliert die Schritte, die die Extraktion, die Verarbeitung im Labor und die Zellkonservierung umfassen. Über die Extraktion und Konservierung hinaus befasst sich das Protokoll mit der Differenzierungsfähigkeit von DPSCs und beschreibt insbesondere die Verfahren, die angewendet werden, um diese Stammzellen zur Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten zu veranlassen, wobei ihre multipotenten Eigenschaften zur Geltung kommen. Die anschließende Anwendung kolorimetrischer Färbetechniken ermöglicht eine genaue Visualisierung und Bestätigung der erfolgreichen Differenzierung, wodurch das Kaliber und die Funktionalität der isolierten DPSCs validiert werden. Dieses umfassende Protokoll fungiert als Blaupause, die das gesamte Spektrum der Extraktion, Kultivierung, Konservierung und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen umfasst. Es unterstreicht das beträchtliche Potenzial von DPSCs, treibt die Erforschung von Stammzellen voran und verspricht zukünftige regenerative und therapeutische Durchbrüche.

Einleitung

Die Stammzellforschung hat in der biomedizinischen Wissenschaft aufgrund ihrer vielversprechenden Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering floriert. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die aus dem Pulpagewebe sowohl menschlicher Milchzähne als auch bleibender Zähne gewonnen werden, haben aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und multipotenten Kapazität als Quelle für Stammzellen großes Interesse geweckt 1,2. Diese Zellen haben das Potenzial, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, darunter Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten, wie zahlreiche Studien bestätigen3.

In den letzten Jahrzehnten haben die Forschung und die therapeutischen Anwendungen von Stammzellen stark zugenommen. Das expansive Potenzial von Stammzellen erfordert eine Diversifizierung der Quellen, aus denen sie gewonnen werden. Mehrere Faktoren beeinflussen die Effizienz, Lebensfähigkeit und Stammheit ausgewählter Zellen. Trotz der Existenz verschiedener bekannter Stammzellreservoire wie Knochenmark und Fettgewebe schränken die invasiven Verfahren, die Morbidität an der Stelle und ethische Bedenken, die mit diesen Quellen verbunden sind, ihre Erforschung oft ein 4,5. Unter den verschiedenen Stammzellquellen haben dentale Stammzellen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit, hohen Plastizität und vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere humane Stammzellen der Zahnpulpa sind hinsichtlich ihrer therapeutischen Aussichten umfassend erforschtworden 6. Zähne, die häufig als medizinischer Abfall entsorgt werden, enthalten eine Fülle von mesenchymalen Stammzellen7. Der Schutz dieses wertvollen Stammzellpools erfordert gemeinsame Anstrengungen von Patienten, Zahnärzten und Ärzten, um sicherzustellen, dass diese Ressourcen nicht verschwendet werden und jede Zahnpulpa-Stammzelle für zukünftige regenerative Anforderungen verfügbar ist.

Aus der Zahnpulpa gewonnene Stammzellen, wie z. B. humane adulte Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) und Stammzellen aus exfolierten menschlichen Milchzähnen (SHED), befinden sich in der perivaskulären Nische der Zahnpulpa. Es wird angenommen, dass diese Zellen aus kranialen Neuralleistenzellen stammen und frühe Marker sowohl für mesenchymale Stammzellen (MSCs) als auch für neuroektodermale Stammzellen aufweisen. DPSCs und SHEDs haben Multipotenz und die Fähigkeit zur Regeneration verschiedener Gewebetypen bewiesen8.

Mögliche Quellen für dentale Stammzellen sind gesunde Milch- und bleibende Zähne. Stammzellen machen nur etwa 1 % der gesamten Zellpopulation in der Pulpa aus, was die Bedeutung wirksamer Isolierungs- und Expansionstechniken unterstreicht9. Folglich sind die Extraktion und Vermehrung dieser Stammzellen entscheidende Schritte bei der DPSC-Isolierung10. Extrahierte oder exfolierte Zähne müssen in einem nährstoffreichen Transportmedium wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks-gepufferter Kochsalzlösung (HBSS) gelagert werden.

Die Gewinnung von Zahnpulpa kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, abhängig vom Zahntyp 7,11. Bei Milchzähnen mit resorbierten Wurzeln kann die Extraktion über die Wurzelspitze erfolgen. In ähnlicher Weise können sterile Stachelräumnadeln verwendet werden, um Pulpa aus bleibenden Zähnen mit einer unreifen offenen Spitze zu gewinnen. Bei bleibenden Zähnen mit voll entwickelten Wurzeln wird für den Zugang zur Pulpakammer die Zahnkrone von der Wurzel getrennt. Dies wird erreicht, indem der Zahn mit einer Diamantscheibe an der Zementschmelzverbindung geschnitten wird. Dieser Schnitt legt die Pulpakammer frei, wodurch das Pulpagewebe entnommen werdenkann 12,13,14.

Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) können durch enzymatischen Verdau (ED) oder Auswuchs aus Gewebeexplantaten (OG) isoliert werden, was auch als spontanes Wachstum bezeichnet wird. Bei der ED-Methode werden Enzyme, hauptsächlich Kollagenase I und Dispase, verwendet, um das Gewebe in einzellige Suspensionen zu zerlegen15,16. Die OG-Methode, die einfacher und schneller ist, besteht darin, die Pulpafragmente zu zerkleinern und direkt in eine Kulturplatte zu legen, so dass die Zellen aus den Gewebeexplantaten wachsen können17. Forscher haben beide Techniken verwendet und verglichen, um die Zellproliferationsraten, die Erhaltung der Eigenschaften isolierter Stammzellen, die Differenzierung und die Expression von Oberflächenmarkern zu bewerten18. Die Etablierung und Standardisierung von Protokollen für den Erwerb von DPSCs mit hoher Effizienz und Stammheit kann den Weg für wirksame und sichere Therapien ebnen19. Dieses Protokoll umfasst die Extraktion von DPSCs durch enzymatischen Verdau, Laborverarbeitung, Konservierung und Zelldifferenzierung mit kolorimetrischer Färbung für Adipogenese, Osteogenese und Chondrogenese.

Das in diesem Artikel skizzierte Protokoll stellt ein schrittweises Verfahren dar, das mit der anfänglichen Isolierung der Zahnpulpa vom Zahn beginnt, gefolgt von der Kultur und Aufrechterhaltung der DPSCs im Labor und schließlich mit ihrer Charakterisierung unter Verwendung spezifischer Stammzellmarker (Abbildung 1). Die Techniken zur Induktion dieser Stammzellen in verschiedene Zelllinien, die ihre Multipotenz hervorheben, werden ebenfalls beschrieben.

Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll entspricht den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Die Verwendung der extrahierten Zähne erfolgte nach ethischen Standards, um die Integrität, Würde und Rechte der Teilnehmer zu gewährleisten. Bei den für diese Studie ausgewählten Teilnehmern handelte es sich um gesunde Personen unter 30 Jahren, die für eine kieferorthopädische Behandlung eine Zahnextraktion benötigten. Personen mit ausgedehnter Zahnkaries oder schwerer Parodontitis wurden von der Studie ausgeschlossen. Milchzähne wurden von Kindern entnommen, die die Extraktion von retinierten Zähnen benötigten. Eine schriftliche Einverständniserklärung der an dieser Studie beteiligten Probanden wurde ebenfalls eingeholt.

1. Extraktion und Transport von Zähnen

  1. Entnahme von Milchzähnen und bleibenden Zähnen
    1. Erklären Sie den Teilnehmern den Zweck des Verfahrens und die mögliche Verwendung der extrahierten Zähne für Forschungszwecke.
    2. Führen Sie die Zahnextraktion unter örtlicher Betäubung durch, indem Sie ein Betäubungsmittel in die Nähe des zu ziehenden Zahns verabreichen. Konkret wurden für diese Studie 1,75 ml Lidocain gemischt mit Adrenalin (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:200.000 injiziert. Die Auswahl von Zähnen, die keine schwere Karies oder Parodontitis aufweisen, ist vorzuziehen20,21.
  2. Transport der extrahierten Zähne
    HINWEIS: Es wird empfohlen, unter aseptischen Bedingungen zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Dazu gehören das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen und einem Laborkittel und das Arbeiten in einer sterilen Umgebung, wie z. B. einer Laminar-Flow-Haube für biologische Gefahren.
    1. Nachdem der Zahn gezogen wurde, spülen Sie ihn mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um Blut und andere Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell vorsichtig alle anhaftenden Weichteilreste von der Zahnoberfläche (Abbildung 2A).
    2. Tauchen Sie den Zahn 10 s lang in eine Desinfektionslösung, z. B. 70%iges Ethanol. Spülen Sie den Zahn nach der Desinfektion mit sterilem PBS, um alle Reste des Desinfektionsmittels wegzuspülen.
    3. Legen Sie den Zahn in ein steriles Gefäß, in dem sich das Transportmedium befindet.
      HINWEIS: Das Transportmedium bestand aus Alpha-MEM, einem handelsüblichen Nährmedium, das mit Antibiotika ergänzt wurde: 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle). Dieses Medium versorgte die Zellen im extrahierten Zahn mit essentiellen Nährstoffen und sicherte ihr Überleben bis zur Laborverarbeitung. Die Antibiotika dienten dazu, das Bakterienwachstum zu hemmen.
    4. Halten Sie während des Transports eine Temperatur von 4 °C aufrecht, um die zellulären Stoffwechselaktivitäten zu verlangsamen und den Zelltod zu verzögern. Transportieren Sie den Zahn für die nächsten Schritte, einschließlich der Verarbeitung und Isolierung der Stammzellen der Zahnpulpa, ins Labor.

2. Entnahme von Pulpagewebe

  1. Sichern Sie den Zahn mit einer Zahnzange, um sicherzustellen, dass er während des Eingriffs an Ort und Stelle bleibt. Verwenden Sie eine Diamantscheibe, um den Zahn in ein zahnärztliches Handstück (siehe Materialtabelle) zu schneiden, das mit einem Kühlmittel verbunden ist (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Das Ziel ist es, die Pulpakammer freizulegen, ohne das Pulpagewebe darin unnötig zu beschädigen.
  2. Verwenden Sie einen Dentalbagger (siehe Materialtabelle), um das Pulpagewebe zu entfernen. Dieses Instrument ermöglicht die Extraktion von Pulpa, ohne Schäden zuzufügen, wodurch die Lebensfähigkeit der Zahnpulpa-Stammzellen erhalten bleibt (Abbildung 2C).
  3. Legen Sie das gewonnene Gewebe auf eine Petrischale aus Glas. Waschen Sie das Pulpagewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

3. Verdauung des Pulpagewebes und Isolierung der Zellen

  1. Zerkleinerung und Verdauung des Gewebes
    1. Mit einer sterilen chirurgischen Klinge das Pulpagewebe vorsichtig in kleine Fragmente zerkleinern (Abbildung 2D) und in eine Mini-Gewebemühle mit PBS geben, um eine fein homogenisierte Mischung zu erhalten. Dieser Prozess vergrößert die Oberfläche des Gewebes und ermöglicht eine effizientere Enzymwirkung während der Verdauung.
    2. Die zerkleinerten homogenen Gewebefragmente werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt und enzymatisch mit einer Mischung aus 3 mg/mL Kollagenase Typ I und 4 mg/ml Dispase verdaut (siehe Materialtabelle). Diese Enzyme wurden in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gelöst, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen.
    3. Das Pulpagewebe wird in der Enzymmischung (Schritt 3.1.2) ca. 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation neutralisieren Sie die Enzyme und sammeln die Zellen durch Zentrifugation (Schritt 3.2.1) für die weitere Kultur.
  2. Zentrifugation und Resuspension
    1. Nach der Inkubation wird das verdaute Gewebe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 x g gedreht, um die Zellen zu pelletieren. In diesem Schritt werden die Zellen von den verbleibenden unverdauten Gewebefragmenten und Enzymen getrennt. Entsorgen Sie das überstehende Medium vorsichtig und achten Sie darauf, das Zellpellet am Boden des Röhrchens nicht zu stören.
    2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem frischen Nährmedium. Dieses Medium bietet die notwendigen Nährstoffe und die Umgebung, damit die isolierten Zellen überleben und sich vermehren können.

4. Zellkultur

  1. Plattierung und Inkubation von Zellen
    1. Die resuspendierten Zellen werden vorsichtig in einen 25 cm² großen Kulturkolben überführt.
      HINWEIS: Das gesamte Material aus einer einzigen Pulpa wird in einen einzigen 25cm 2-Zell-Kulturkolben überführt. Ein Medienvolumen von 5-7 mL sorgt für eine ausreichende Abdeckung und Nährstoffverfügbarkeit der Zellen. Stellen Sie sicher, dass das Kulturmedium für DPSCs Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ist, das mit 10 % bis 20 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird (siehe Materialtabelle), um die erforderlichen Wachstumsfaktoren bereitzustellen. Ergänzen Sie das Medium außerdem mit 1 % Penicillin/Streptomycin, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig im Kolben verteilt sind, um ein homogenes Wachstum zu fördern.
    2. Der Kolben wird bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 -Gehalt inkubiert.
  2. Mittlere Änderung und Überwachung der Konfluenz
    1. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage, um frische Nährstoffe bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. Aspirieren Sie dazu das alte Medium vorsichtig mit einer sterilen serologischen Pipette und ersetzen Sie es durch ein frisches Medium.
    2. Überwachen Sie die Zellkultur regelmäßig unter einem Mikroskop, um das Wachstum der Zellen zu verfolgen und auf Anzeichen einer Kontamination zu prüfen.
    3. Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, den Punkt, an dem die Zellen den größten Teil der Kolbenoberfläche bedecken, aber nicht übermäßig überfüllt sind.
  3. Zelltrypsinisierung und Passing oder Einfrieren
    1. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um das Restmedium und nicht adhärente Zellen zu entfernen.
    2. Geben Sie eine Lösung von 0,25 % Trypsin-EDTA in den Kolben, um die Zellen von der Oberfläche des Kolbens zu lösen. 2-5 min bei 37 °C inkubieren, bis die Zellen abheben.
    3. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen Kulturmedium hinzufügen, und pipettieren Sie dann die Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um eine vollständige Zellablösung zu gewährleisten.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in einem frischen Kulturmedium und plattieren Sie sie entweder für weiteres Wachstum neu (Passage) oder frieren Sie sie für die zukünftige Verwendung ein. Verwenden Sie beim Einfrieren ein Gefriermedium, das ein Kryoprotektivum wie DMSO enthält, um die Zellen vor Schäden während des Einfrierens zu schützen.

5. Charakterisierung von DPSCs

  1. Durchflusszytometrische Analyse
    1. Um die mesenchymale Stammzellnatur der isolierten Zellen zu bestätigen, ist eine durchflusszytometrische Analysedurchzuführen 22,23. Zunächst trypsinisieren und sammeln Sie Zellen, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
    2. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypanfarbstoff-Ausschlusstechnik. Führen Sie die Analyse mit einem Zellviabilitätsanalysator (siehe Materialtabelle) während der 2. und 8. Passage durch. Führen Sie während der 3. und 7. Passage eine phänotypische Analyse mit einem Durchflusszytometer durch.
    3. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation in einem Durchflusszytometrie-Puffer, um überschüssige Antikörper zu entfernen, und analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.
      HINWEIS: Der Durchflusszytometrie-Puffer besteht aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS), 1 % -2 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 % Natriumazid (NaN3). Das FBS oder BSA blockiert die unspezifische Bindung von Antikörpern, während das Natriumazid als Konservierungsmittel wirkt. Ein hoher Prozentsatz der Zellen sollte die mesenchymalen Stammzellmarker exprimieren und es fehlen die hämatopoetischen Marker, was ihre Identität als DPSCsbestätigt 24.
    4. Entfernen Sie die DPSCs und färben Sie sie mit Immunfluoreszenz-Antikörpern für die durchflusszytometrische Analyse.
      HINWEIS: Die Auswahl der Marker für die durchflusszytometrische Analyse von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) basiert auf dem von der International Society for Cellular Therapy (ISCT) festgelegten Konsens, der besagt, dass MSCs CD105, CD73 und CD90 exprimieren sollten und die Expression von CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79a oder CD19 und HLA-KlasseII 25 fehlt. Diese Marker werden häufig in Studien zur Untersuchung von Stammzellen der Zahnpulpa verwendet26. Die Konzentrationen der Antikörper für die Färbung können je nach verwendetem Antikörper variieren, und es wird empfohlen, die Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) für Antikörperverdünnungen und Inkubationsbedingungenzu befolgen 25.
    5. Festlegung der Einstufungskriterien27,28 für die Ausprägung von CD-Markern wie erwähnt: weniger als 10 %, keine Ausprägung; zwischen 11 % und 40 %, geringe Ausprägung; ein Bereich von 41 % bis 70 %, moderate Ausprägung; über 71%, hohe Ausprägung.
    6. Bestätigen Sie zusätzlich das Fehlen hämatopoetischer Marker, indem Sie ein separates Zellaliquot mit Antikörpern gegen CD34 und CD45 inkubieren.

6. Differenzierung mehrerer Abstammungslinien

HINWEIS: In den folgenden Schritten werden Protokolle für die osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierung von dentalen Stammzellen beschrieben. Beginnen Sie mit der Aussaat von Kulturen mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Vertiefung in einer mit Fibronektin beschichteten Gewebekulturplatte mit vollständigem Medium (CM). Überwachen Sie das Zellwachstum, bis eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht ist, bevor das gewünschte Differenzierungsprotokoll eingeleitet wird. Um das Multilinien-Differenzierungspotenzial der DPSCs zu bewerten, initiieren Sie den Differenzierungsprozess in Richtung Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten, indem Sie Zellen in 24-Well-Platten aussäen und sie in geeigneten Differenzierungsmedien kultivieren.

  1. Osteogene Differenzierung
    1. Beginnen Sie mit der Kultivierung von DPSCs in einem regulären Wachstumsmedium unter Standardbedingungen, bis sie einen Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
    2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Fügen Sie den Zellen das osteogene Differenzierungsmedium (ODM) hinzu.
      HINWEIS: Das ODM besteht aus Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM), ergänzt mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 mM Beta-Glycerophosphat und 100 nM Dexamethason (siehe Materialtabelle).
    3. Inkubieren Sie die Zellen im osteogenen Medium bei 37 °C mit 5 % CO2. Wechseln Sie das osteogene Medium alle 2-3 Tage.
      HINWEIS: Nach 14 bis 21 Tagen sollten sich die DPSCs zu osteoblastenähnlichen Zellen differenziert haben. Dies kann bestätigt werden, indem man auf eine Erhöhung der Expression von Osteoblasten-spezifischen Markern, wie z. B. alkalischer Phosphatase, prüft, oder indem Färbetechniken zum Nachweis mineralisierter Matrix, wie z. B. Alizarinrot-S-Färbung, verwendet werden.
    4. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 1 h lang bei -20 °C mit 70 % eiskaltem Ethanol inkubieren.
    5. Färben Sie die fixierten Zellen mit 40 nM Alizarinrot S (pH 4,2) Färbelösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 10-15 min. Visualisieren Sie die Färbung unter einem Mikroskop, um die osteogene Differenzierung zu bestätigen (Abbildung 3). Die Differenzierung wird durch Färbung der Zellen mit Alizarin Red S bestätigt, das Kalziumablagerungen identifiziert, die auf eine Mineralisierung hinweisen29,30.
  2. Adipogene Differenzierung
    1. Wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, kultivieren Sie DPSCs unter Standardbedingungen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C. Passieren Sie die Zellen, wenn sie etwa 70 % bis 80 % Konfluenz erreichen.
    2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Ersetzen Sie das ausgewaschene Medium durch ein adipogenes Differenzierungsmedium. Dieses Medium besteht in der Regel aus DMEM, 10 % FBS, 10 μg/ml Insulin, 1 μM Dexamethason, 200 μM Indomatacin und 0,5 mM IBMX (siehe Materialtabelle).
    3. Wechseln Sie das Differenzierungsmedium alle 3-4 Tage. Nach ca. 3 Wochen die adipogen-differenzierten DPSCs mit PBS waschen und mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur fixieren.
    4. Färben Sie die fixierten Zellen mit Oil Red O (siehe Materialtabelle), um die Ansammlung von Lipidtröpfchen sichtbar zu machen (Abbildung 4). Um die adipogene Differenzierung weiter zu bestätigen, führen Sie eine Genexpressionsanalyse von adipogenen Markern wie Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor gamma (PPARγ) und Adiponektindurch 31,32.
  3. Chondrogene Differenzierung
    1. DPSCs-Kulturen, die in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten werden, werden für die chondrogene Differenzierung verwendet. Passieren Sie die Zellen, wenn sie etwa 70 % bis 80 % Konfluenz erreichen.
    2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Ersetzen Sie das ausgewaschene Medium durch chondrogenes Differenzierungsmedium, das typischerweise Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 1 % ITS, 100 nM Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbat-2-phosphat, 40 μg/ml Prolin und 10 ng/ml Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) enthält (siehe Materialtabelle).
    3. Halten Sie die Zellen im chondrogenen Differenzierungsmedium und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Nach etwa drei Wochen sollten sich die DPSCs zu chondrozytenähnlichen Zellen differenziert haben.
    4. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) inkubieren. Nach der Fixierung färben Sie die Zellen mit Alcianblau (siehe Materialtabelle) und visualisieren Sie sie unter einem Mikroskop, um die chondrogene Differenzierung zu bestätigen (Abbildung 5).
    5. Bestätigung der Differenzierung von DPSCs in Chondrozyten mit Techniken wie der Alcianblau-Färbung für Proteoglykane oder der Genexpressionsanalyse von chondrogenen Markern wie Aggrecan, SOX9 und Typ-II-Kollagen33,34.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Durchführung des skizzierten Protokolls führte zu Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die in der Lage sind, mehrere Linien zu differenzieren, was ihre Multipotenz demonstriert.

Viabilitäts-Assays
Die Viabilität der DPSCs wurde unter Verwendung eines Trypanblau-Ausschlussassays zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet. Die Ergebnisse zeigen eine konstant hohe Lebensfähigkeit (mehr als 95%) über den gesamten Kulturzeitraum, was die Robustheit unseres Isolations...

Diskussion

Das Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen. Es enthält eine Beschreibung der Lagerung und Proliferation dieser Zellen sowie die Bewertung ihres in vitro Differenzierungspotenzials in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten35.

Chen et al.36 zeigten, dass Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus versch...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Mathew Mazhavancheril, Direktor und Leiter des Pushpagiri-Forschungszentrums in Thiruvalla, für seine Unterstützung bei der Dokumentation der Abläufe im Forschungszentrum.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

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