JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo enfatiza la extracción, el cultivo y la preservación de células madre multipotentes de la pulpa dental a través de la digestión enzimática. Además, demuestra su potencial para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos, lo que pone de manifiesto la importancia de la precisión y la consistencia en el proceso.

Resumen

En el ámbito de la medicina regenerativa y las aplicaciones terapéuticas, la investigación con células madre está ganando terreno rápidamente. Las células madre de la pulpa dental (DPSC), que están presentes tanto en los dientes deciduos como en los permanentes, se han convertido en una fuente vital de células madre debido a su accesibilidad, adaptabilidad y capacidades innatas de diferenciación. Las DPSC ofrecen un reservorio abundante y fácilmente disponible de células madre mesenquimales, que muestran una versatilidad y un potencial impresionantes, particularmente para fines regenerativos. A pesar de su promesa, el principal obstáculo radica en aislar y caracterizar eficazmente las DPSC, dada su representación como una fracción diminuta dentro de las células de la pulpa dental. Igualmente crucial es la preservación adecuada de este invaluable recurso celular. Los dos métodos predominantes para el aislamiento de DPSC son la digestión enzimática (DE) y el crecimiento a partir de explantes tisulares (OG), a menudo denominado crecimiento espontáneo. Este protocolo se concentra principalmente en el enfoque de digestión enzimática para el aislamiento de DPSC, detallando detalladamente los pasos que abarcan la extracción, el procesamiento en el laboratorio y la preservación de células. Más allá de la extracción y la preservación, el protocolo profundiza en la destreza de diferenciación de las DPSC, en concreto, describe los procedimientos empleados para inducir a estas células madre a diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y condrocitos, mostrando sus atributos multipotentes. La utilización posterior de técnicas de tinción colorimétrica facilita la visualización precisa y la confirmación de la diferenciación exitosa, validando así el calibre y la funcionalidad de las DPSC aisladas. Este protocolo integral funciona como un modelo que abarca todo el espectro de extracción, cultivo, preservación y caracterización de células madre de pulpa dental. Subraya el potencial sustancial que albergan las DPSC, impulsando la exploración avanzada con células madre y siendo prometedor para futuros avances regenerativos y terapéuticos.

Introducción

La investigación con células madre ha florecido en la ciencia biomédica debido a sus prometedoras aplicaciones en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Las células madre de la pulpa dental (CPDP), derivadas del tejido pulpar de los dientes deciduos y permanentes humanos, han atraído un interés significativo como fuente de células madre debido a su disponibilidad inmediata y capacidad multipotente 1,2. Estas células tienen el potencial de diferenciarse en varios tipos de células, incluidos los adipocitos, los osteoblastos y los condrocitos, como lo confirman numerosos estudios3.

En las últimas décadas, la investigación y las aplicaciones terapéuticas de las células madre han aumentado. El potencial expansivo de las células madre exige diversificar las fuentes de las que se obtienen. Varios factores influyen en la eficiencia, la viabilidad y la madre de las células elegidas. A pesar de la existencia de varios reservorios de células madre conocidos, como la médula ósea y los tejidos adiposos, los procedimientos invasivos, la morbilidad del sitio y las preocupaciones éticas relacionadas con estas fuentes a menudo limitan su exploración 4,5. Entre las diversas fuentes de células madre, las células madre dentales han ganado atención debido a su fácil accesibilidad, alta plasticidad y diversas aplicaciones potenciales. Las células madre de la pulpa dental humana, en particular, han sido ampliamente investigadas por sus perspectivas terapéuticas6. Los dientes, comúnmente desechados como desechos médicos, contienen una gran cantidad de células madre mesenquimales. Salvaguardar este valioso grupo de células madre requiere esfuerzos colectivos de pacientes, dentistas y médicos para garantizar que estos recursos no se desperdicien, haciendo que cada célula madre de la pulpa dental esté disponible para futuros requisitos regenerativos.

Las células madre derivadas de la pulpa dental, como las células madre de la pulpa dental adulta humana (DPSC) y las células madre de los dientes deciduos humanos exfoliados (SHED), se encuentran en el nicho perivascular de la pulpa dental. Se cree que estas células se originan a partir de células de la cresta neural craneal y exhiben marcadores tempranos tanto para las células madre mesenquimales (MSC) como para las células madre neuroectodérmicas. Las DPSC y las SHEDs han demostrado multipotencia y la capacidad de regenerar diversos tipos de tejidos8.

Las fuentes potenciales de células madre dentales abarcan dientes deciduos y permanentes sanos. Las células madre constituyen solo alrededor del 1% de la población total de células en la pulpa, lo que pone de relieve la importancia de técnicas efectivas de aislamiento y expansión9. En consecuencia, la extracción y expansión de estas células madre son pasos fundamentales en el aislamiento de DPSC10. Los dientes extraídos o exfoliados deben almacenarse en un medio de transporte rico en nutrientes, como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con Hanks (HBSS).

La obtención de pulpa dental se puede lograr a través de varios métodos, dependiendo del tipo de diente 7,11. En el caso de los dientes deciduos con raíces reabsorbidas, la extracción se puede realizar a través del ápice de la raíz. Del mismo modo, las brochas de púas estériles se pueden utilizar para obtener pulpa de dientes permanentes con un ápice abierto inmaduro. En los casos de dientes permanentes con raíces completamente desarrolladas, el acceso a la cámara pulpar implica separar la corona dental de la raíz. Esto se logra cortando el diente con un disco de diamante en la unión del esmalte cementado. Esta incisión expone la cámara pulpar, permitiendo la recuperación del tejido pulpar 12,13,14.

Las células madre de la pulpa dental (DPSC) se pueden aislar a través de la digestión enzimática (ED) o el crecimiento de explantes de tejido (OG), también conocido como crecimiento espontáneo. El método ED emplea enzimas, principalmente colagenasa I y dispasa, para descomponer el tejido en suspensiones unicelulares15,16. El método OG, más simple y rápido, consiste en picar los fragmentos de pulpa y colocarlos directamente en una placa de cultivo, permitiendo que las células crezcan a partir de los explantes de tejido17. Los investigadores han utilizado y comparado ambas técnicas para evaluar las tasas de proliferación celular, la preservación de las propiedades de las células madre aisladas, la diferenciación y la expresión de marcadores de superficie18. El establecimiento y la normalización de protocolos para la adquisición de CPDP con alta eficiencia y eficacia pueden allanar el camino para terapias eficaces y seguras19. Este protocolo abarca la extracción de DPSC mediante digestión enzimática, procesamiento de laboratorio, preservación y diferenciación celular con tinción colorimétrica para adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis.

El protocolo descrito en este artículo presenta un procedimiento paso a paso, que comienza con el aislamiento inicial de la pulpa dental del diente, seguido por el cultivo y mantenimiento de las CPDP en el laboratorio, y concluye con su caracterización utilizando marcadores específicos de células madre (Figura 1). También se describen las técnicas para inducir estas células madre en diferentes linajes celulares, destacando su multipotencia.

Protocolo

El protocolo descrito en este documento se ajusta a las directrices del comité institucional de ética de la investigación en seres humanos (IRB, Centro de Investigación Pushpagiri, Kerala). El uso de los dientes extraídos se llevó a cabo siguiendo normas éticas para garantizar la integridad, la dignidad y los derechos de los participantes. Los participantes seleccionados para este estudio fueron individuos sanos menores de 30 años que requirieron extracción dental para tratamiento ortodóncico. Se excluyeron del estudio aquellos con caries dental extensa o periodontitis severa. Se recolectaron dientes deciduos de niños que requirieron la extracción de dientes retenidos. También se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos involucrados en este estudio.

1. Extracción y transporte de los dientes

  1. Colección de dientes deciduos y permanentes
    1. Explique a los participantes el propósito del procedimiento y el uso potencial de los dientes extraídos con fines de investigación.
    2. Realizar la extracción dental bajo anestesia local mediante la administración de un agente anestésico en las proximidades del diente a extraer. En concreto, se inyectaron 1,75 mL de lidocaína mezclada con epinefrina (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:200.000 para este estudio. Es preferible seleccionar dientes que no presenten caries dental severa o periodontitis20,21.
  2. Transporte de los dientes extraídos
    NOTA: Se recomienda trabajar en condiciones asépticas para evitar la contaminación. Esto incluye usar equipo de protección personal, como guantes y una bata de laboratorio, y trabajar en un entorno estéril, como una capucha de flujo laminar de riesgo biológico.
    1. Después de extraer el diente, enjuáguelo con una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y otros desechos. Con pinzas estériles y bisturí, retire con cuidado cualquier resto de tejido blando adherido a la superficie del diente (Figura 2A).
    2. Sumerja el diente en una solución desinfectante, como etanol al 70%, durante 10 s. Después de la desinfección, enjuague el diente con PBS estéril para eliminar cualquier residuo de desinfectante.
    3. Coloque el diente en un recipiente estéril que contenga el medio de transporte.
      NOTA: El medio de transporte consistió en Alpha-MEM, un medio de cultivo comercial suplementado con antibióticos: 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (ver Tabla de Materiales). Este medio suministraba nutrientes esenciales a las células dentro del diente extraído, asegurando su supervivencia hasta el procesamiento en el laboratorio. Los antibióticos servían para inhibir el crecimiento bacteriano.
    4. Mantener una temperatura de 4 °C durante el transporte para ralentizar las actividades metabólicas celulares y retrasar la muerte celular. Transportar el diente al laboratorio para los siguientes pasos, incluido el procesamiento y el aislamiento de las células madre de la pulpa dental.

2. Recolección de tejido pulpar

  1. Asegure el diente con pinzas dentales para asegurarse de que permanezca en su lugar durante el procedimiento. Use un disco de diamante para cortar el diente en una pieza de mano dental (consulte la Tabla de materiales) conectada a un refrigerante de agua (Figura 2B).
    NOTA: El objetivo es exponer la cámara pulpar sin causar daños innecesarios al tejido pulpar en su interior.
  2. Utilice una excavadora dental (consulte la tabla de materiales) para eliminar el tejido pulpar. Este instrumento permite la extracción de la pulpa sin causar daños, preservando así la viabilidad de las células madre de la pulpa dental (Figura 2C).
  3. Coloque el tejido obtenido en una placa de Petri de vidrio. Lave el tejido pulpar con solución salina tamponada con fosfato.

3. Digestión del tejido pulpar y aislamiento celular

  1. Picado y digestión de tejidos
    1. Con una cuchilla quirúrgica estéril, picar cuidadosamente el tejido pulpar en pequeños fragmentos (Figura 2D) y colocarlo en un mini triturador de pañuelos con PBS para obtener una mezcla finamente homogeneizada. Este proceso aumenta la superficie del tejido, facilitando una acción enzimática más eficiente durante la digestión.
    2. Transfiera los fragmentos de tejido homogéneo picados a un tubo de 15 mL y digiera enzimáticamente utilizando una mezcla de 3 mg/mL de colagenasa tipo I y 4 mg/ml de dispasa (ver Tabla de Materiales). Estas enzimas se disolvieron en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para lograr las concentraciones deseadas.
    3. Incubar el tejido de la pulpa en la mezcla de enzimas (paso 3.1.2) durante unas 2 h a 37 °C. Después de la incubación, neutralice las enzimas y recoja las células por centrifugación (paso 3.2.1) para su posterior cultivo.
  2. Centrifugación y resuspensión
    1. Después de la incubación, transfiera el tejido digerido a un tubo de centrífuga de 15 ml y gire a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para granular las células. Este paso separa las células de los fragmentos de tejido y enzimas restantes no digeridos. Deseche con cuidado el medio sobrenadante, asegurándose de no alterar la pastilla celular en la parte inferior del tubo.
    2. Vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo fresco. Este medio proporciona los nutrientes y el entorno necesarios para que las células aisladas sobrevivan y proliferen.

4. Cultivo celular

  1. Siembra e incubación de células
    1. Transfiera con cuidado las células resuspendidas a un matraz de cultivo de 25 cm².
      NOTA: Todo el material de una sola pulpa se transfiere a un solo matraz de cultivo celular de25 cm2. Un volumen de medio de 5-7 ml garantiza una cobertura suficiente y disponibilidad de nutrientes para las células. Asegúrese de que el medio de cultivo para las DPSC sea el Medio de Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado con un 10%-20% de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales) para proporcionar los factores de crecimiento necesarios. Además, complemente el medio con penicilina/estreptomicina al 1% para prevenir la contaminación bacteriana. Asegúrese de que las células estén distribuidas uniformemente por todo el matraz para promover un crecimiento homogéneo.
    2. Incubar el matraz a 37 °C en una atmósfera que contenga 5% de CO2.
  2. Cambio de medio y confluencia de seguimiento
    1. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días para proporcionar nutrientes frescos y eliminar los desechos metabólicos. Para ello, aspire cuidadosamente el medio antiguo con una pipeta serológica estéril y sustitúyalo por un medio nuevo.
    2. Monitoree regularmente el cultivo celular bajo un microscopio para rastrear el crecimiento de las células y verificar si hay signos de contaminación.
    3. Continúe este proceso hasta que las celdas alcancen el 80%-90% de confluencia, el punto en el que las celdas cubren la mayor parte de la superficie del matraz pero no están demasiado abarrotadas.
  3. Tripsinización celular y passaging o congelación
    1. Una vez que las células alcancen el 80%-90% de confluencia, retire el medio de cultivo y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el medio residual y las células no adherentes.
    2. Añadir una solución de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz para separar las células de la superficie del matraz. Incubar durante 2-5 min a 37 °C hasta que las células despeguen.
    3. Neutralice la tripsina agregando un volumen igual de medio de cultivo, luego pipetee suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para asegurar el desprendimiento completo de la célula.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las celdas.
    5. Vuelva a suspender las células en un medio de cultivo fresco y vuelva a colocarlas (paso) para un mayor crecimiento o congélelas para su uso futuro. Al congelar, use un medio de congelación que contenga un crioprotector, como DMSO, para proteger las células del daño durante la congelación.

5. Caracterización de las CPDP

  1. Análisis de citometría de flujo
    1. Para confirmar la naturaleza de las células madre mesenquimales de las células aisladas, se realizó un análisis de citometría de flujo22,23. Inicialmente, tripsinice y recoja células como se describe en el paso 4.3.
    2. Determinar la viabilidad celular mediante la técnica de exclusión de colorante tripán. Realice el análisis utilizando un analizador de viabilidad celular (ver Tabla de Materiales) durante el2º y8º pasaje. Realizar análisis fenotípicos a través de un citómetro de flujo durante el3º y7º paso.
    3. Después de la incubación, lave las células en un tampón de citometría de flujo para eliminar el exceso de anticuerpos y analice las células con un citómetro de flujo.
      NOTA: El tampón de citometría de flujo está compuesto por solución salina tamponada con fosfato (1x PBS), 1%-2% de suero fetal bovino (FBS) y 0,1% de azida de sodio (NaN3). El FBS o BSA bloquea la unión inespecífica de los anticuerpos, mientras que la azida de sodio actúa como conservante. Un alto porcentaje de células deben expresar los marcadores de células madre mesenquimales y carecer de los marcadores hematopoyéticos, lo que confirma su identidad como DPSCs24.
    4. Separe las DPSC y tíñalas con anticuerpos de inmunofluorescencia para el análisis de citometría de flujo.
      NOTA: La selección de marcadores para el análisis por citometría de flujo de células madre mesenquimales (MSC) se basa en el consenso establecido por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), que establece que las MSC deben expresar CD105, CD73 y CD90, y carecer de la expresión de CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19, y HLA clase II25. Estos marcadores se utilizan comúnmente en estudios que investigan las células madre de la pulpa dental26. Las concentraciones de anticuerpos para la tinción pueden variar dependiendo del anticuerpo específico utilizado, y se recomienda seguir las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales) para diluciones de anticuerpos y condiciones de incubación25.
    5. Establecer los criterios de clasificación 27,28 para la expresión de los marcadores CD mencionados: menos del 10%, ninguna expresión; entre el 11% y el 40%, baja expresión; un rango de 41% a 70%, expresión moderada; por encima del 71%, alta expresión.
    6. Además, confirmar la ausencia de marcadores hematopoyéticos mediante la incubación de una alícuota celular separada con anticuerpos contra CD34 y CD45.

6. Diferenciación multilinaje

NOTA: Los siguientes pasos describen los protocolos para la diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica de las células madre dentales. Comience sembrando cultivos a una densidad de 1 x 105 células por pocillo en una placa de cultivo de tejido recubierta de fibronectina con medio completo (CM). Monitorizar el crecimiento celular hasta alcanzar un 80%-90% de confluencia antes de iniciar el protocolo de diferenciación deseado. Para evaluar el potencial de diferenciación multilinaje de las DPSC, inicie el proceso de diferenciación hacia osteoblastos, adipocitos y condrocitos mediante la siembra de células en placas de 24 pocillos y su cultivo en medios de diferenciación adecuados.

  1. Diferenciación osteogénica
    1. Comience cultivando DPSC en un medio de crecimiento regular en condiciones estándar hasta que alcancen un 70%-80% de confluencia.
    2. Retire el medio de crecimiento de las células, luego lávelas una vez con 1x PBS. Agregue el medio de diferenciación osteogénica (ODM) a las células.
      NOTA: El ODM consiste en Medio Esencial Mínimo Alfa (α-MEM) suplementado con 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de beta-glicerofosfato y 100 nM de dexametasona (ver Tabla de Materiales).
    3. Incubar las células en el medio osteogénico a 37 °C con 5% de CO2. Cambie el medio osteogénico cada 2-3 días.
      NOTA: Después de 14 a 21 días, las DPSC deberían haberse diferenciado en células similares a los osteoblastos. Esto puede confirmarse mediante la comprobación de un aumento en la expresión de marcadores específicos de osteoblastos, como la fosfatasa alcalina, o mediante el uso de técnicas de tinción para detectar la matriz mineralizada, como la tinción con Alizarin Red S.
    4. Fije las células incubándolas con etanol helado al 70% durante 1 h a -20 °C.
    5. Teñir las células fijas con 40 nM de solución de tinción de Alizarin Red S (pH 4,2) a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10-15 min. Visualice la tinción bajo un microscopio para confirmar la diferenciación osteogénica (Figura 3). Confirmar la diferenciación tiñendo las células con Alizarina Roja S, que identifica depósitos de calcio indicativos de mineralización29,30.
  2. Diferenciación adipogénica
    1. Como se detalló en la sección anterior, cultive DPSC en condiciones estándar en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C. Pasa las células cuando alcanzan alrededor del 70%-80% de confluencia.
    2. Aspire el medio y lave las células una vez con 1x PBS. Reemplace el medio lavado con medio de diferenciación adipogénico. Este medio generalmente consta de DMEM, 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 1 μM de dexametasona, 200 μM de indometacina y 0,5 mM de IBMX (ver Tabla de Materiales).
    3. Cambie el medio de diferenciación cada 3-4 días. Después de aproximadamente 3 semanas, lave las DPSC adipogénicas diferenciadas con PBS y fíjelas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    4. Teñir las células fijas con Oil Red O (ver Tabla de Materiales) para visualizar la acumulación de gotas de lípidos (Figura 4). Para confirmar aún más la diferenciación adipogénica, se realiza un análisis de expresión génica de marcadores adipogénicos como el receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ) y la adiponectina31,32.
  3. Diferenciación condrogénica
    1. Los cultivos de DPSCs mantenidos en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C se utilizan para la diferenciación condrogénica. Pasa las células cuando alcanzan alrededor del 70%-80% de confluencia.
    2. Aspire el medio y lave las células una vez con 1x PBS. Reemplace el medio lavado con un medio de diferenciación condrogénico, que generalmente contiene medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, 1% de ITS, 100 nM de dexametasona, 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL de prolina y 10 ng/mL de factor de crecimiento transformante-beta 3 (TGF-β3) (ver Tabla de materiales).
    3. Mantener las células en el medio de diferenciación condrogénica, cambiando el medio cada 2-3 días. Después de unas tres semanas, las DPSC deberían haberse diferenciado en células similares a los condrocitos.
    4. Fije las células incubándolas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, tiñir las células con azul alcián (ver Tabla de Materiales) y visualizarlas bajo un microscopio para confirmar la diferenciación condrogénica (Figura 5).
    5. Confirmar la diferenciación de las DPSCs en condrocitos utilizando técnicas como la tinción con azul alcián para proteoglicanos o el análisis de expresión génica de marcadores condrogénicos como el agrecano, el SOX9 y el colágeno tipo II33,34.

Resultados

La ejecución exitosa del protocolo descrito produjo células madre de pulpa dental (DPSC) capaces de diferenciarse multilinaje, demostrando su multipotencia.

Ensayos de viabilidad
La viabilidad de las DPSC se evaluó mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano en varios momentos. Los resultados muestran una alta viabilidad (superior al 95%) durante todo el período de cultivo, lo que demuestra la solidez de nuestro protocolo de aislamiento y cultivo.

Discusión

El protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de pulpa dental (DPSC) a partir de dientes deciduos y permanentes humanos. Incluye una descripción del almacenamiento y proliferación de estas células, así como la evaluación de su potencial de diferenciación in vitro en osteoblastos, adipocitos y condrocitos35.

Chen et al.36 demostraron que las células madre de la pulpa dent...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Mathew Mazhavancheril, Director y Jefe del Centro de Investigación Pushpagiri en Thiruvalla, por su apoyo en la documentación de los procedimientos en el Centro de Investigación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

Referencias

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891 (2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175 (2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. . Regenerative medicine-from protocol to patient. , 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572 (2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945 (2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392 (2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372 (2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114 (2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854 (2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434 (2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -. G., George, J. -. M., Sweety, V. -. K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906 (2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89 (2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531 (2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213 (2015).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Palabras clave C lulas madre de la pulpa dentalDPSCdientes deciduosdientes permanentesmedicina regenerativac lulas madre mesenquimalesdigesti n enzim ticaexcrecenciaadipocitososteoblastoscondrocitosmultipotentediferenciaci naislamiento celularcultivo celularpreservaci n celular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados